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Bio production à l’échelle pilote d’un hydrolysat peptidique à partir de sang entier bovin et porcin pour l’industrie du Petfood et l’alimentation animale : Identification et caractérisation des peptides actifs
Bio production à l’échelle pilote d’un hydrolysat peptidique à partir de sang entier bovin et porcin pour l’industrie du Petfood et l’alimentation animale : Identification et caractérisation des peptides actifs


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Le sang brut issu des abattoirs est une source importante de protéines. Il est actuellement peu valorisé, essentiellement par séchage ou par récupération de molécules plasmatiques après séparation centrifuge du plasma et du cruor. Ce co-produit est principalement composé d’hémoglobine, protéine riche en peptides actifs, tels que les peptides antimicrobiens, après hydrolyse par la pepsine porcine. L’objectif est de proposer une nouvelle stratégie de valorisation du sang, sans séparation plasma-cruor, tout en conservant les peptides bioactifs historiquement identifiés lors de l’hydrolyse pepsique de l’hémoglobine purifiée. Cette nouvelle voie, mise au point puis optimisée à l’échelle laboratoire, a été technologiquement transférée à l’échelle pilote. L’hydrolyse pepsique du sang a été premièrement mise au point à la concentration de 1% (p/v) en hémoglobine. Cette hydrolyse a mis en évidence la coexistence des mécanismes enzymatiques de type zipper et one-by-one pour l’apparition de la population peptidique. Les conditions d’hydrolyses (concentration en hémoglobine, choix de la pepsine, rapport enzyme-substrat, acide et temps d’hydrolyse) ont été optimisées en fixant une décoloration complète de l’hydrolysat ainsi que la conservation de la population peptidique. L’hydrolysat bioactif ainsi obtenu présente des propriétés antimicrobiennes et antioxydantes. Son analyse par spectrométrie de masse a permis la caractérisation de cet hydrolysat en terme de peptides issus de l’hémoglobine. Il ne possède aucune masse supérieure à 10 kDa, lui procurant ainsi une bonne digestibilité: son utilisation en alimentation animale en tant que complément alimentaire apparaît prometteuse.
Raw blood from slaughterhouses is an important source of proteins. This co-product, currently undervalued, is mainly composed of hemoglobin, a protein rich in active peptides such as antimicrobial peptides, after hydrolysis by porcine pepsin. The aim of this thesis is to propose a new strategy for the valorization of whole blood, without plasma-cruor separation. Preservation of identified bioactive peptides by pepsic hydrolysis of purified hemoglobin is required. This new way of blood valorization, developed and then optimized at laboratory scale, has been technologically transferred on a pilot scale (80 L). The pepsic hydrolysis of 70% bovine 30% porcine blood was first developed at 1% (w/v) of hemoglobin (23°C, 200 mL). This hydrolysis has demonstrated the coexistence of zipper and one by one enzymatic mechanism for the appearance of the peptide population. Hydrolysis parameters (hemoglobin concentration, industrial grade pepsin, enzyme-substrate proportion, acid allowing the sustainability of the hydrolysis pH and hydrolysis time) were optimized by fixing a complete discoloration of the hydrolysate as well as the preservation of the peptide population. The bioactive hydrolysate thus obtained contains antimicrobial and antioxidant properties. Mass spectrometry analysis has shown the hydrolysate composition in terms of peptides derived from hemoglobin. No mass above 10 kDa have been found, providing it with a good digestibility: its use in pet food as a food supplement seems promising.
Le sang brut issu des abattoirs est une source importante de protéines. Il est actuellement peu valorisé, essentiellement par séchage ou par récupération de molécules plasmatiques après séparation centrifuge du plasma et du cruor. Ce co-produit est principalement composé d’hémoglobine, protéine riche en peptides actifs, tels que les peptides antimicrobiens, après hydrolyse par la pepsine porcine. L’objectif est de proposer une nouvelle stratégie de valorisation du sang, sans séparation plasma-cruor, tout en conservant les peptides bioactifs historiquement identifiés lors de l’hydrolyse pepsique de l’hémoglobine purifiée. Cette nouvelle voie, mise au point puis optimisée à l’échelle laboratoire, a été technologiquement transférée à l’échelle pilote. L’hydrolyse pepsique du sang a été premièrement mise au point à la concentration de 1% (p/v) en hémoglobine. Cette hydrolyse a mis en évidence la coexistence des mécanismes enzymatiques de type zipper et one-by-one pour l’apparition de la population peptidique. Les conditions d’hydrolyses (concentration en hémoglobine, choix de la pepsine, rapport enzyme-substrat, acide et temps d’hydrolyse) ont été optimisées en fixant une décoloration complète de l’hydrolysat ainsi que la conservation de la population peptidique. L’hydrolysat bioactif ainsi obtenu présente des propriétés antimicrobiennes et antioxydantes. Son analyse par spectrométrie de masse a permis la caractérisation de cet hydrolysat en terme de peptides issus de l’hémoglobine. Il ne possède aucune masse supérieure à 10 kDa, lui procurant ainsi une bonne digestibilité: son utilisation en alimentation animale en tant que complément alimentaire apparaît prometteuse.
Raw blood from slaughterhouses is an important source of proteins. This co-product, currently undervalued, is mainly composed of hemoglobin, a protein rich in active peptides such as antimicrobial peptides, after hydrolysis by porcine pepsin. The aim of this thesis is to propose a new strategy for the valorization of whole blood, without plasma-cruor separation. Preservation of identified bioactive peptides by pepsic hydrolysis of purified hemoglobin is required. This new way of blood valorization, developed and then optimized at laboratory scale, has been technologically transferred on a pilot scale (80 L). The pepsic hydrolysis of 70% bovine 30% porcine blood was first developed at 1% (w/v) of hemoglobin (23°C, 200 mL). This hydrolysis has demonstrated the coexistence of zipper and one by one enzymatic mechanism for the appearance of the peptide population. Hydrolysis parameters (hemoglobin concentration, industrial grade pepsin, enzyme-substrate proportion, acid allowing the sustainability of the hydrolysis pH and hydrolysis time) were optimized by fixing a complete discoloration of the hydrolysate as well as the preservation of the peptide population. The bioactive hydrolysate thus obtained contains antimicrobial and antioxidant properties. Mass spectrometry analysis has shown the hydrolysate composition in terms of peptides derived from hemoglobin. No mass above 10 kDa have been found, providing it with a good digestibility: its use in pet food as a food supplement seems promising.
06-11-2019
06-11-2019
Thèse
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Artificially induced anisotropy of thermal conductivity in 2D Si phononic membranes
Artificially induced anisotropy of thermal conductivity in 2D Si phononic membranes


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Ce travail de thèse est consacré au développement de mécanismes pratiques pour le guidage de chaleur dans des nanostructures de silicium de faible dimension. Les applications vont du domaine de la gestion thermique des circuits intégrés aux technologies et matériaux thermoélectriques émergents à base de Si, dans lesquels le guidage thermique de la chaleur peut jouer un rôle important. L'objectif est d'étudier expérimentalement la faisabilité d'une anisotropie de conductivité thermique (κ) dans le plan, induite artificiellement, des membranes nanostructurées en Si. En combinant la thermométrie Raman, la modélisation optique et la modélisation par éléments finis (FEM), il a été possible de mesurer le gradient thermique, la conductance de la membrane et de déterminer les conductivités thermiques effectives. Cette expérience confirme la possibilité d’induire artificiellement une anisotropie élevée de κ dans des membranes en silicium. Un modèle FEM paramétré conçu à dessein a démontré la mise en œuvre possible des effets anisotropes induits dans le domaine de la gestion thermique des circuits intégrés.
This thesis work is devoted to the development of practical mechanisms for the heat guiding in silicon low-dimensional nanostructures. The motivation comes from both the field of IC thermal management and emerging technology of Si-based thermoelectric devices, where directional heat guiding can play an important role. A series of micrometre-sized thermal characterisation platforms was designed and fabricated. The objective is to study experimentally the feasibility of artificially-induced in-plane anisotropy of effective thermal conductivity (κ) in Si nanopatterned membranes. By the combined use of micro Raman Thermometry, Rigorous Coupled Wave Analysis and Finite Element Modelling (FEM) it was possible to measure the thermal gradient, membrane conductance and determine effective thermal conductivities. This experiment confirms the possibility to induce artificially high anisotropy of κ in Si phononic membranes. Finally, purposefully designed parameterized FEM model demonstrated the possible implementation of the induced anisotropic effects in the area of IC thermal-management.
Ce travail de thèse est consacré au développement de mécanismes pratiques pour le guidage de chaleur dans des nanostructures de silicium de faible dimension. Les applications vont du domaine de la gestion thermique des circuits intégrés aux technologies et matériaux thermoélectriques émergents à base de Si, dans lesquels le guidage thermique de la chaleur peut jouer un rôle important. L'objectif est d'étudier expérimentalement la faisabilité d'une anisotropie de conductivité thermique (κ) dans le plan, induite artificiellement, des membranes nanostructurées en Si. En combinant la thermométrie Raman, la modélisation optique et la modélisation par éléments finis (FEM), il a été possible de mesurer le gradient thermique, la conductance de la membrane et de déterminer les conductivités thermiques effectives. Cette expérience confirme la possibilité d’induire artificiellement une anisotropie élevée de κ dans des membranes en silicium. Un modèle FEM paramétré conçu à dessein a démontré la mise en œuvre possible des effets anisotropes induits dans le domaine de la gestion thermique des circuits intégrés.
This thesis work is devoted to the development of practical mechanisms for the heat guiding in silicon low-dimensional nanostructures. The motivation comes from both the field of IC thermal management and emerging technology of Si-based thermoelectric devices, where directional heat guiding can play an important role. A series of micrometre-sized thermal characterisation platforms was designed and fabricated. The objective is to study experimentally the feasibility of artificially-induced in-plane anisotropy of effective thermal conductivity (κ) in Si nanopatterned membranes. By the combined use of micro Raman Thermometry, Rigorous Coupled Wave Analysis and Finite Element Modelling (FEM) it was possible to measure the thermal gradient, membrane conductance and determine effective thermal conductivities. This experiment confirms the possibility to induce artificially high anisotropy of κ in Si phononic membranes. Finally, purposefully designed parameterized FEM model demonstrated the possible implementation of the induced anisotropic effects in the area of IC thermal-management.
05-11-2019
05-11-2019
Thèse
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The comparative biochemistry of storage polysaccharide metabolism in Chlamydiales and Cyanobacteria: insights into the evolution of glycogen and starch metabolism in Eukaryotes
The comparative biochemistry of storage polysaccharide metabolism in Chlamydiales and Cyanobacteria: insights into the evolution of glycogen and starch metabolism in Eukaryotes


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Le glycogène et l’amidon sont les formes de polysaccharides de réserve les plus répandues. Ils sont tous deux constitués de résidus de glucose liés en α-1,4, et branchés en α-1,6. Bien qu’ils se distinguent fortement par leurs propriétés physico-chimiques, l’amidon a évolué à partir d’un métabolisme du glycogène préexistant. Il est apparu après l’endosymbiose primaire du plaste qui a eu lieu il y a plus d’un milliard d’années entre une cellule eucaryote et une cyanobactérie. Il a été proposé que l’endosymbiose primaire du plaste ait impliqué la manipulation du métabolisme des polysaccharides de réserve par une bactérie intracellulaire obligatoire pathogène qui appartient à l’ordre des Chlamydiales. Afin de comprendre l'histoire évolutive des gènes du métabolisme du glycogène, et enquêter sur l’implication d’une bactérie de l’ordre des Chlamydiales dans l’endosymbiose plastidiale, nous nous sommes intéressés à l’évolution des polysaccharides chez les cyanobactéries et les Chlamydiales. Nous avons donc disséqué le fonctionnement de ce métabolisme chez Cyanobacterium sp. CLg1, une cyanobactérie de l’ordre des Chroococcales qui accumule simultanément de l’amidon et du glycogène. D’autres part, nous avons étudié l’évolution du métabolisme des polysaccharides de réserve chez les Chlamydiales. La plupart des enzymes du métabolisme du glycogène des Chlamydiales ont été caractérisées. Les résultats de la caractérisation renforcent notre théorie de ménage à trois et l’implication des Chlamydiales dans l’établissement de l’endosymbiose primaire du plaste. L’impact du métabolisme du glycogène des Chlamydiales sur l’évolution de celui des plantes et des animaux est discuté.
Glycogen and starch are the most commonly found forms of storage polysaccharides. They both consist solely of glucose residues linked and branched respectively through α-1,4 and α-1,6 glycosidic bonds. Although they considerably differ in their physicochemical properties, starch evolved in only a few steps in eukaryotes from the pre-existing eukaryotic glycogen metabolism. It appeared, after primary plastidial endosymbiosis which took place over one billion years ago between an ancestral cyanobacterium and a heterotrophic eukaryotic host. This endosymbiosis has been recently proposed in the “Ménage à Trois Hypothesis” (MATH) to have been triggered and facilitated through manipulation of glycogen metabolism by obligate intracellular bacteria pathogens, belonging to the order Chlamydiales. In order to understand the evolutionary history of glycogen metabolism genes, and to investigate the possible nature of the Chlamydiales involvement in primary plastid endosymbiosis, we probed the evolution of storage polysaccharide metabolism in both extant Chroococcales and Chlamydiales. So we dissected the functioning of the metabolism in Cyanobacterium sp. CLg1, a cyanobacterium of order Chroococcales that simultaneously accumulate starch and glycogen. On the other hand, we investigated the evolution of storage polysaccharide metabolism in Chlamydiales. Several recombinant enzymes of glycogen metabolism were thus characterized. Our characterization strengthens the MATH and the implication of the Chlamydiales in the establishement of primary plastidial endosymbiosis. The importance of our findings with respect to the evolution of glycogen metabolism in animals and plants is discussed.
Le glycogène et l’amidon sont les formes de polysaccharides de réserve les plus répandues. Ils sont tous deux constitués de résidus de glucose liés en α-1,4, et branchés en α-1,6. Bien qu’ils se distinguent fortement par leurs propriétés physico-chimiques, l’amidon a évolué à partir d’un métabolisme du glycogène préexistant. Il est apparu après l’endosymbiose primaire du plaste qui a eu lieu il y a plus d’un milliard d’années entre une cellule eucaryote et une cyanobactérie. Il a été proposé que l’endosymbiose primaire du plaste ait impliqué la manipulation du métabolisme des polysaccharides de réserve par une bactérie intracellulaire obligatoire pathogène qui appartient à l’ordre des Chlamydiales. Afin de comprendre l'histoire évolutive des gènes du métabolisme du glycogène, et enquêter sur l’implication d’une bactérie de l’ordre des Chlamydiales dans l’endosymbiose plastidiale, nous nous sommes intéressés à l’évolution des polysaccharides chez les cyanobactéries et les Chlamydiales. Nous avons donc disséqué le fonctionnement de ce métabolisme chez Cyanobacterium sp. CLg1, une cyanobactérie de l’ordre des Chroococcales qui accumule simultanément de l’amidon et du glycogène. D’autres part, nous avons étudié l’évolution du métabolisme des polysaccharides de réserve chez les Chlamydiales. La plupart des enzymes du métabolisme du glycogène des Chlamydiales ont été caractérisées. Les résultats de la caractérisation renforcent notre théorie de ménage à trois et l’implication des Chlamydiales dans l’établissement de l’endosymbiose primaire du plaste. L’impact du métabolisme du glycogène des Chlamydiales sur l’évolution de celui des plantes et des animaux est discuté.
Glycogen and starch are the most commonly found forms of storage polysaccharides. They both consist solely of glucose residues linked and branched respectively through α-1,4 and α-1,6 glycosidic bonds. Although they considerably differ in their physicochemical properties, starch evolved in only a few steps in eukaryotes from the pre-existing eukaryotic glycogen metabolism. It appeared, after primary plastidial endosymbiosis which took place over one billion years ago between an ancestral cyanobacterium and a heterotrophic eukaryotic host. This endosymbiosis has been recently proposed in the “Ménage à Trois Hypothesis” (MATH) to have been triggered and facilitated through manipulation of glycogen metabolism by obligate intracellular bacteria pathogens, belonging to the order Chlamydiales. In order to understand the evolutionary history of glycogen metabolism genes, and to investigate the possible nature of the Chlamydiales involvement in primary plastid endosymbiosis, we probed the evolution of storage polysaccharide metabolism in both extant Chroococcales and Chlamydiales. So we dissected the functioning of the metabolism in Cyanobacterium sp. CLg1, a cyanobacterium of order Chroococcales that simultaneously accumulate starch and glycogen. On the other hand, we investigated the evolution of storage polysaccharide metabolism in Chlamydiales. Several recombinant enzymes of glycogen metabolism were thus characterized. Our characterization strengthens the MATH and the implication of the Chlamydiales in the establishement of primary plastidial endosymbiosis. The importance of our findings with respect to the evolution of glycogen metabolism in animals and plants is discussed.
04-11-2019
04-11-2019
Thèse
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Phénomènes moléculaires dans l’endommagement de l’ADN par rayonnements ionisants
Phénomènes moléculaires dans l’endommagement de l’ADN par rayonnements ionisants


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Cette thèse est consacrée à une enquête sur la structure et la dynamique, avec des modèles théoriques et essais de laboratoire, sur deux types communs de défauts arrivant dans la molécule d’ADN, après des dégâts de radiation ou le produit chimique: mésappariements des base(MB) et casseurs de brin. Tels défauts pourraient arriver naturellement, d’imperfections dans le processus cellulaire, induit par l’environnement et ou induit artificiellement, comme pour la radiothérapie de cancer. Nous avons utilisé la spectroscopie de force moléculaire exécutée par des pinces optiques accompagnées par des simulations all-atom en Dynamique Moléculaire (MD), pour caractériser des MB dans des hairpin d’ADN. Ensuite nous avons construit des modèles structurels pour les casseurs de brin d’ADN, dans les deux indexent les éléments constitutifs de la chromatine: le ADN linker et le nucléosome. Grâce à l'application de diffèrent techniques (Essential Dynamics, Steered MD, …) on a caractérisé les stades précoces de l’évolution de cette lésion d’ADN dans les deux éléments.
This thesis is dedicated to a combined theoretical and experimental investigation of the structure and dynamics of two common types of defects occurring in the DNA molecule, after chemical or radiation damage: base mismatches and strand breaks. We used single-molecule force spectroscopy performed by optical tweezers accompanied by Molecular Dynamics (MD) all-atom simulations, to characterize mismatches in short DNA hairpins. We demonstrate that it is possible to use SMFS. Subsequently, we designed structural models for the DNA strand-break defects, in the two key constitutive elements of the chromatin: the DNA linker and the nucleosome. Using different techniques (Essential Dynamics, steered MD, covariant mechanical stress, …) we characterized the early stages of the evolution of this DNA lesion in the two elements.
Cette thèse est consacrée à une enquête sur la structure et la dynamique, avec des modèles théoriques et essais de laboratoire, sur deux types communs de défauts arrivant dans la molécule d’ADN, après des dégâts de radiation ou le produit chimique: mésappariements des base(MB) et casseurs de brin. Tels défauts pourraient arriver naturellement, d’imperfections dans le processus cellulaire, induit par l’environnement et ou induit artificiellement, comme pour la radiothérapie de cancer. Nous avons utilisé la spectroscopie de force moléculaire exécutée par des pinces optiques accompagnées par des simulations all-atom en Dynamique Moléculaire (MD), pour caractériser des MB dans des hairpin d’ADN. Ensuite nous avons construit des modèles structurels pour les casseurs de brin d’ADN, dans les deux indexent les éléments constitutifs de la chromatine: le ADN linker et le nucléosome. Grâce à l'application de diffèrent techniques (Essential Dynamics, Steered MD, …) on a caractérisé les stades précoces de l’évolution de cette lésion d’ADN dans les deux éléments.
This thesis is dedicated to a combined theoretical and experimental investigation of the structure and dynamics of two common types of defects occurring in the DNA molecule, after chemical or radiation damage: base mismatches and strand breaks. We used single-molecule force spectroscopy performed by optical tweezers accompanied by Molecular Dynamics (MD) all-atom simulations, to characterize mismatches in short DNA hairpins. We demonstrate that it is possible to use SMFS. Subsequently, we designed structural models for the DNA strand-break defects, in the two key constitutive elements of the chromatin: the DNA linker and the nucleosome. Using different techniques (Essential Dynamics, steered MD, covariant mechanical stress, …) we characterized the early stages of the evolution of this DNA lesion in the two elements.
04-11-2019
04-11-2019
Thèse
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Oxidation of omega-3 oils and preservation by natural phenolic antioxidants
Oxidation of omega-3 oils and preservation by natural phenolic antioxidants


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Les oméga-3 sont reconnus comme étant des acides gras essentiels pour la santé. Ils sont particulièrement sensibles à l’oxygène et sont donc sujets à une dégradation oxydante conduisant à la détérioration de leurs propriétés organoleptique et nutraceutique. Il est donc crucial de protéger les huiles oméga-3 contre l’oxydation par l’ajout d’antioxydants, mais sans danger pour les consommateurs. Afin de retarder l’oxydation, des antioxydants phénoliques synthétiques tels que le BHA et le BHT sont largement utilisés mais suscitent la méfiance des consommateurs. La tendance actuelle est donc de les remplacer par des composés naturels (seuls ou en mélange) conduisant à des effets synergiques, souvent observés mais rarement compris, permettant une meilleure inhibition de l’oxydation. En ajoutant à ceci des mécanismes complexes se produisant lors de la dégradation des acides gras polyinsaturés, ce travail de thèse a été réalisé avec un triple objectif : la détection et l’identification des traces de produits oxydés dans les huiles, la mise en évidence des conditions relatives à la structure chimique des phénols performants et la clarification des mécanismes de fonctionnement des mélanges d’antioxydants. La spectrométrie de masse couplée à une ionisation par électronébulisation (ESI-MS) apparaît être la technique la plus appropriée pour l’ionisation sélective et sensible d’hydroperoxydes intacts identifiés comme les produits d’oxydation primaires. De plus, l’huile de lin, étant l’huile végétale la plus riche en oméga-3, a été notre substrat d’étude. Plus de 70 phénols inhibant l’oxydation radicalaire en chaîne par transfert d’hydrogène aux radicaux péroxyles ont été testés.
Omega-3 has been known as essential fatty acids to health. They are particularly sensitive to oxygen leading to a deterioration of their organoleptic and nutraceutical properties. Protecting omega-3 oils against oxidation is then crucial and requires the addition of highly effective antioxidants but safe for consumers. In order to prevent oxidative degradation, synthetic phenolic antioxidants such as BHT and BHA are widely used but they provoke safety concern from the consumer side. Therefore, the current tendency is to replace them by natural compounds used alone or in mixture, which leads to synergistic effects, often observed but rarely understood. Adding this to the complex mechanism occurring in the degradation of polyunsaturated fatty acids, this thesis was composed by 3 objectives: the detection and identification of traces of oxidation products in oils, the highlight of the requirements of the chemical structures of efficient phenols and the clarification of the mechanisms of action between antioxidants. The electrospray mass spectrometry (ESI-MS) appears as the most suitable technique for the selective and sensitive ionization of intact hydroperoxides which are the primary oxidation products. In addition, the linseed oil, known as the richest vegetable oil in omega-3, was our substrate of study. Over than 70 phenols which inhibit the radical chain oxidation by hydrogen transfer to peroxyl radicals were tested.
Les oméga-3 sont reconnus comme étant des acides gras essentiels pour la santé. Ils sont particulièrement sensibles à l’oxygène et sont donc sujets à une dégradation oxydante conduisant à la détérioration de leurs propriétés organoleptique et nutraceutique. Il est donc crucial de protéger les huiles oméga-3 contre l’oxydation par l’ajout d’antioxydants, mais sans danger pour les consommateurs. Afin de retarder l’oxydation, des antioxydants phénoliques synthétiques tels que le BHA et le BHT sont largement utilisés mais suscitent la méfiance des consommateurs. La tendance actuelle est donc de les remplacer par des composés naturels (seuls ou en mélange) conduisant à des effets synergiques, souvent observés mais rarement compris, permettant une meilleure inhibition de l’oxydation. En ajoutant à ceci des mécanismes complexes se produisant lors de la dégradation des acides gras polyinsaturés, ce travail de thèse a été réalisé avec un triple objectif : la détection et l’identification des traces de produits oxydés dans les huiles, la mise en évidence des conditions relatives à la structure chimique des phénols performants et la clarification des mécanismes de fonctionnement des mélanges d’antioxydants. La spectrométrie de masse couplée à une ionisation par électronébulisation (ESI-MS) apparaît être la technique la plus appropriée pour l’ionisation sélective et sensible d’hydroperoxydes intacts identifiés comme les produits d’oxydation primaires. De plus, l’huile de lin, étant l’huile végétale la plus riche en oméga-3, a été notre substrat d’étude. Plus de 70 phénols inhibant l’oxydation radicalaire en chaîne par transfert d’hydrogène aux radicaux péroxyles ont été testés.
Omega-3 has been known as essential fatty acids to health. They are particularly sensitive to oxygen leading to a deterioration of their organoleptic and nutraceutical properties. Protecting omega-3 oils against oxidation is then crucial and requires the addition of highly effective antioxidants but safe for consumers. In order to prevent oxidative degradation, synthetic phenolic antioxidants such as BHT and BHA are widely used but they provoke safety concern from the consumer side. Therefore, the current tendency is to replace them by natural compounds used alone or in mixture, which leads to synergistic effects, often observed but rarely understood. Adding this to the complex mechanism occurring in the degradation of polyunsaturated fatty acids, this thesis was composed by 3 objectives: the detection and identification of traces of oxidation products in oils, the highlight of the requirements of the chemical structures of efficient phenols and the clarification of the mechanisms of action between antioxidants. The electrospray mass spectrometry (ESI-MS) appears as the most suitable technique for the selective and sensitive ionization of intact hydroperoxides which are the primary oxidation products. In addition, the linseed oil, known as the richest vegetable oil in omega-3, was our substrate of study. Over than 70 phenols which inhibit the radical chain oxidation by hydrogen transfer to peroxyl radicals were tested.
04-11-2019
04-11-2019
Thèse
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Mort cellulaire initiée par l'oxygène singulet : mise en évidence d'effets à longue portée
Mort cellulaire initiée par l'oxygène singulet : mise en évidence d'effets à longue portée


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L'oxygène singulet (1O2) , premier état électronique excité du dioxygène, est l'agent cytotoxique majeur en photo-thérapie dynamique. Nous avons utilisé l'activation optique directe du dioxygène pour faire un lien quantitatif entre taux de production d'1O2 et mort cellulaire. Dans des sphéroïdes tumoraux, qui reproduisent in vitro la géométrie des tumeurs, nous mettons en évidence de la mort cellulaire à longue portée qui ne peut être expliquée par l'action directe de 1O2 . Cette mort est due à de l' 1O2 produit au sein des sphéroïdes mais à l'extérieur des cellules. Nous avons mis en place une expérience qui nous permets de contrôler spatialement la production de 1O2 à l'extérieur des cellules. La mort cellulaire observée à longue portée dans ces expériences implique la présence d'espèces réactives de l'oxygène secondaires. Enfin, certaines modalités de mort sont privilégiées du point de vue thérapeutique pour, entre autres, limiter la réponse inflammatoire. Nous avons mis en place une expérience in vitro qui nous permet d'observer différentes modalités de mort en fonction du taux de production de 1O2 et de la durée d'exposition.
Singlet oxygen (1O2) is the first excited state of molecular oxygen. It is the major cytotoxic agent in photo-dynamic therapy. We use direct optical excitation of oxygen to quantitatively estimate 1O2 production rate in cells and to study its cytotoxic effects. In multicellular tumor spheroids, which mimic tumor geometry in vitro, we highlight long-range cell death that cannot be explained by singlet oxygen alone. This death is caused by 1O2 generated within spheroids but outside of the cells. We set up an experiment enabling spatial control of extra-cellular 1O2 production. The measured long-range cell death in these experiments implies the presence of secondary reactive oxygen species. Lastly, some cell death modalities are preferred from a treatment perspective, in order, for example, to limit inflammatory response. We set up an in vitro experiment that enabled us to observe different cell death modalities according to 1O2 production rates and exposure times.
L'oxygène singulet (1O2) , premier état électronique excité du dioxygène, est l'agent cytotoxique majeur en photo-thérapie dynamique. Nous avons utilisé l'activation optique directe du dioxygène pour faire un lien quantitatif entre taux de production d'1O2 et mort cellulaire. Dans des sphéroïdes tumoraux, qui reproduisent in vitro la géométrie des tumeurs, nous mettons en évidence de la mort cellulaire à longue portée qui ne peut être expliquée par l'action directe de 1O2 . Cette mort est due à de l' 1O2 produit au sein des sphéroïdes mais à l'extérieur des cellules. Nous avons mis en place une expérience qui nous permets de contrôler spatialement la production de 1O2 à l'extérieur des cellules. La mort cellulaire observée à longue portée dans ces expériences implique la présence d'espèces réactives de l'oxygène secondaires. Enfin, certaines modalités de mort sont privilégiées du point de vue thérapeutique pour, entre autres, limiter la réponse inflammatoire. Nous avons mis en place une expérience in vitro qui nous permet d'observer différentes modalités de mort en fonction du taux de production de 1O2 et de la durée d'exposition.
Singlet oxygen (1O2) is the first excited state of molecular oxygen. It is the major cytotoxic agent in photo-dynamic therapy. We use direct optical excitation of oxygen to quantitatively estimate 1O2 production rate in cells and to study its cytotoxic effects. In multicellular tumor spheroids, which mimic tumor geometry in vitro, we highlight long-range cell death that cannot be explained by singlet oxygen alone. This death is caused by 1O2 generated within spheroids but outside of the cells. We set up an experiment enabling spatial control of extra-cellular 1O2 production. The measured long-range cell death in these experiments implies the presence of secondary reactive oxygen species. Lastly, some cell death modalities are preferred from a treatment perspective, in order, for example, to limit inflammatory response. We set up an in vitro experiment that enabled us to observe different cell death modalities according to 1O2 production rates and exposure times.
04-11-2019
04-11-2019
Thèse
Thèse

Influence de paramètres physico-chimiques sur la cristallisation d’oxalates de lanthanides et d’actinides, précurseurs d’oxydes : orientation des microstructures
Influence de paramètres physico-chimiques sur la cristallisation d’oxalates de lanthanides et d’actinides, précurseurs d’oxydes : orientation des microstructures


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La thèse s’insère dans le cadre d’études menées sur la conversion d’actinides en oxydes par le biais de précurseurs solides oxalate obtenus par précipitation ou cristallisation. Une compréhension poussée de cette étape initiale de formation de la phase solide à partir des éléments en solution est essentielle, car les caractéristiques morphologiques et structurales du précurseur oxalate contribuent à orienter le comportement aux opérations de pastillage et frittage de l’oxyde. Le travail de thèse est centré sur l’influence des paramètres physico-chimiques de précipitation et porte, en premier lieu, sur des systèmes simples simulants des actinides. Une étude de la cristallisation de l’oxalate de néodyme(III) permet ainsi d’identifier différents hydrates d’oxalate(III), dont la structure cristalline est en lien avec différentes morphologies. Les tendances dégagées orientent la suite des essais concernant la précipitation de l’oxalate de néodyme(III), phénomène plus difficilement maîtrisé que la cristallisation. Notamment, les paramètres température et ajout d’additifs dits « structurants » ou « non structurants » sont retenus. L’étude est enfin étendue à l’oxalate de thorium(IV) et à l’oxalate mixte thorium(IV)-néodyme(III) avant d’être appliquée à l’oxalate de plutonium(III). Les essais de précipitation réalisés sur ce dernier système aboutissent à l’obtention d’oxalates de plutonium de structure et/ou de morphologie différente et, par conséquent, d’oxydes de morphologie différente.
This work is in line with studies concerning actinides conversion by oxalic precipitation. This process leads to the precipitation of actinide oxalate compounds used as oxides precursors. As oxalate compounds keep their morphology through a pseudomorphic transformation when calcined into oxides, having control over their morphology is a key aspect for the control of some oxides properties. The thesis deals with the influence of physical-chemical parameters of oxalic precipitation and concerns, at first, surrogate systems of actinides. Neodymium(III) oxalate crystallization is firstly studied, and enables the identification of several Nd(III) oxalate hydrates with various morphologies, which depend on their crystalline structure. This preliminary study is used to guide the next part of the work dedicated to the study of neodymium(III) oxalate precipitation, this phenomenon being even more difficult to control than crystallization. Parameters such as temperature and influence of “structuring” and “non structuring” additives are studied. The study is then extended to thorium(IV) oxalate and mixed thorium(IV)-neodymium(III) oxalate before its application to plutonium(III) oxalate system. The experiments concerning this last system result in the obtention of plutonium oxalates with different structure and/or morphology, which, consequently, leads to plutonium oxides with different morphology.
La thèse s’insère dans le cadre d’études menées sur la conversion d’actinides en oxydes par le biais de précurseurs solides oxalate obtenus par précipitation ou cristallisation. Une compréhension poussée de cette étape initiale de formation de la phase solide à partir des éléments en solution est essentielle, car les caractéristiques morphologiques et structurales du précurseur oxalate contribuent à orienter le comportement aux opérations de pastillage et frittage de l’oxyde. Le travail de thèse est centré sur l’influence des paramètres physico-chimiques de précipitation et porte, en premier lieu, sur des systèmes simples simulants des actinides. Une étude de la cristallisation de l’oxalate de néodyme(III) permet ainsi d’identifier différents hydrates d’oxalate(III), dont la structure cristalline est en lien avec différentes morphologies. Les tendances dégagées orientent la suite des essais concernant la précipitation de l’oxalate de néodyme(III), phénomène plus difficilement maîtrisé que la cristallisation. Notamment, les paramètres température et ajout d’additifs dits « structurants » ou « non structurants » sont retenus. L’étude est enfin étendue à l’oxalate de thorium(IV) et à l’oxalate mixte thorium(IV)-néodyme(III) avant d’être appliquée à l’oxalate de plutonium(III). Les essais de précipitation réalisés sur ce dernier système aboutissent à l’obtention d’oxalates de plutonium de structure et/ou de morphologie différente et, par conséquent, d’oxydes de morphologie différente.
This work is in line with studies concerning actinides conversion by oxalic precipitation. This process leads to the precipitation of actinide oxalate compounds used as oxides precursors. As oxalate compounds keep their morphology through a pseudomorphic transformation when calcined into oxides, having control over their morphology is a key aspect for the control of some oxides properties. The thesis deals with the influence of physical-chemical parameters of oxalic precipitation and concerns, at first, surrogate systems of actinides. Neodymium(III) oxalate crystallization is firstly studied, and enables the identification of several Nd(III) oxalate hydrates with various morphologies, which depend on their crystalline structure. This preliminary study is used to guide the next part of the work dedicated to the study of neodymium(III) oxalate precipitation, this phenomenon being even more difficult to control than crystallization. Parameters such as temperature and influence of “structuring” and “non structuring” additives are studied. The study is then extended to thorium(IV) oxalate and mixed thorium(IV)-neodymium(III) oxalate before its application to plutonium(III) oxalate system. The experiments concerning this last system result in the obtention of plutonium oxalates with different structure and/or morphology, which, consequently, leads to plutonium oxides with different morphology.
04-11-2019
04-11-2019
Thèse
Thèse

Étude par microscopie à sonde locale des propriétés électriques de monocouches auto-assemblées de molécules photo-commutables sur substrats ferromagnétiques
Étude par microscopie à sonde locale des propriétés électriques de monocouches auto-assemblées de molécules photo-commutables sur substrats ferromagnétiques


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Ce manuscrit traite du transport à travers des monocouches auto-assemblées (self-assembled monolayers, SAMs) de molécules photoisomérisables greffées sur des matériaux ferromagnétiques (FMs) pour des applications à la frontière de l'électronique moléculaire et de la spintronique. Ces systèmes sont étudiés par le mode conductif du microscope à force atomique, à l'air et sous ultravide. Il est attendu que les jonctions FM-SAM/pointe présentent une photo-commutation de résistance au cours de cycles d'irradiation. Un premier couple FM-SAM allie le manganite de lanthane dopé au strontium (LSMO) à un dérivé de diaryléthène (DDA). Il est montré que la diminution des courants à travers la SAM après irradiation UV, d'un ratio 5, ne saurait être liée à la photoisomérisation de DDA mais à la modification du LSMO par échauffement. De même, le champ électrique et la force appliqués par la sonde conduisent au switch-off intempestif du LSMO. Cet effet est cependant fortement diminué lorsque le substrat est passivé par une SAM de DDA. Le second système étudié est un dérivé d'azobenzène (AzBT) greffé sur cobalt. Co-AzBT montre une photo-commutation de résistance partiellement réversible avec un ratio de courant de 21 à +0,5 V. Le cobalt exposé à l'air ambiant montre également une commutation de résistance sous l'action de la sonde. Ce phénomène est quasi-absent lorsque le métal est protégé par une SAM. Ces travaux illustrent les difficultés inhérentes à l'emploi de FMs mais ouvrent cependant de nouvelles voies vers des dispositifs opto-spintroniques hybrides exploitant les couplages entre conformation moléculaire et transport polarisé en spin.
This thesis focuses on electrical transport through self-assembled monolayers (SAMs) of photoisomerisable compounds grafted on ferromagnetic materials (FMs) for applications at the frontier between molecular electronics and spintronics. These systems have been characterized by conductive atomic force microscopy under ambient conditions and ultra-high vacuum. FM-SAM/tip junctions are expected to show resistance photoswitching during irradiation cycles. The first FM-SAM couple consists of lanthanum strontium manganite (LSMO) and a diarylethene derivative (DDA). We show that the switch-off of LSMO-DDA after UV irradiation, characterized by a ratio 5 of current, does not result from DDA isomerization but rather from LSMO heating. Similarly, electric field and strain applied by the tip also lead to the switch-off of the LSMO. Nevertheless, this last effect is disrupted when LSMO is protected by a DDA SAM. The second system studied is an azobenzene derivative grafted on cobalt. Co-AzBT exhibits an ON/OFF current ratio up to 21 at +0,5 V, partially reversible. Tip-induced switch-off was also observed on air exposed cobalt but is quasi-absent when the substrate is protected by a SAM. Despite showing the difficulties inherent to the use of FMs, this work sheds light on new ways to realize hybrid opto-spintronics molecular devices, triggered by isomerization and spin-polarized transport.
Ce manuscrit traite du transport à travers des monocouches auto-assemblées (self-assembled monolayers, SAMs) de molécules photoisomérisables greffées sur des matériaux ferromagnétiques (FMs) pour des applications à la frontière de l'électronique moléculaire et de la spintronique. Ces systèmes sont étudiés par le mode conductif du microscope à force atomique, à l'air et sous ultravide. Il est attendu que les jonctions FM-SAM/pointe présentent une photo-commutation de résistance au cours de cycles d'irradiation. Un premier couple FM-SAM allie le manganite de lanthane dopé au strontium (LSMO) à un dérivé de diaryléthène (DDA). Il est montré que la diminution des courants à travers la SAM après irradiation UV, d'un ratio 5, ne saurait être liée à la photoisomérisation de DDA mais à la modification du LSMO par échauffement. De même, le champ électrique et la force appliqués par la sonde conduisent au switch-off intempestif du LSMO. Cet effet est cependant fortement diminué lorsque le substrat est passivé par une SAM de DDA. Le second système étudié est un dérivé d'azobenzène (AzBT) greffé sur cobalt. Co-AzBT montre une photo-commutation de résistance partiellement réversible avec un ratio de courant de 21 à +0,5 V. Le cobalt exposé à l'air ambiant montre également une commutation de résistance sous l'action de la sonde. Ce phénomène est quasi-absent lorsque le métal est protégé par une SAM. Ces travaux illustrent les difficultés inhérentes à l'emploi de FMs mais ouvrent cependant de nouvelles voies vers des dispositifs opto-spintroniques hybrides exploitant les couplages entre conformation moléculaire et transport polarisé en spin.
This thesis focuses on electrical transport through self-assembled monolayers (SAMs) of photoisomerisable compounds grafted on ferromagnetic materials (FMs) for applications at the frontier between molecular electronics and spintronics. These systems have been characterized by conductive atomic force microscopy under ambient conditions and ultra-high vacuum. FM-SAM/tip junctions are expected to show resistance photoswitching during irradiation cycles. The first FM-SAM couple consists of lanthanum strontium manganite (LSMO) and a diarylethene derivative (DDA). We show that the switch-off of LSMO-DDA after UV irradiation, characterized by a ratio 5 of current, does not result from DDA isomerization but rather from LSMO heating. Similarly, electric field and strain applied by the tip also lead to the switch-off of the LSMO. Nevertheless, this last effect is disrupted when LSMO is protected by a DDA SAM. The second system studied is an azobenzene derivative grafted on cobalt. Co-AzBT exhibits an ON/OFF current ratio up to 21 at +0,5 V, partially reversible. Tip-induced switch-off was also observed on air exposed cobalt but is quasi-absent when the substrate is protected by a SAM. Despite showing the difficulties inherent to the use of FMs, this work sheds light on new ways to realize hybrid opto-spintronics molecular devices, triggered by isomerization and spin-polarized transport.
04-11-2019
04-11-2019
Thèse
Thèse

Etude des relations structurales et fonctionnelles entre le domaine 2 de la protéine NS5A du virus de l’hépatite C et la Cyclophiline A humaine
Etude des relations structurales et fonctionnelles entre le domaine 2 de la protéine NS5A du virus de l’hépatite C et la Cyclophiline A humaine


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Le Virus de l’Hépatite C (VHC) est un virus à ARN de polarité positive infectant plus de 130 millions de personnes dans le monde. Les inhibiteurs de Cyclophilines sont prometteurs en tant que nouvelles molécules thérapeutiques contre l'infection par le VHC. La Cyclophiline A, une protéine de l’hôte, joue un rôle essentiel pour la réplication de l’ARN viral mais sa fonction reste à élucider. La protéine non structurale du VHC NS5A (et plus particulièrement son domaine 2, NS5A-D2) est impliquée dans le mécanisme d’action de la CypA, étant donné que des mutations de résistances apparaissent dans ce domaine sous pression de sélection à la Cyclosporine A (CsA), l’inhibiteur connu de la CypA possédant une activité anti-VHC. NS5A est une protéine multifonctionnelle faiblement caractérisée au niveau moléculaire. Cette protéine est strictement requise pour la réplication de l’ARN viral mais ses fonctions moléculaires précises restent à élucider. Le domaine 2 désordonné de NS5A interagit directement avec la CypA et constitue un site substrat pour l’activité peptidyl-prolyl cis/trans isomérase de la CypA. Le site d’interaction au niveau de NS5A-D2 correspond à la région la plus conservée du domaine. Dans cette région la mutation D316E confère une résistance à la CsA. Au cours de ce travail, nous avons identifié et caractérisé par RMN un petit motif structural au sein de NS5A-D2 localisé au niveau de cette région particulière. Nous montrons que ce petit motif structural est essentiel pour la réplication de l’ARN du VHC. Nous avons également analysé les conséquences structurales des mutations de résistances aux inhibiteurs de Cyclophiline A, ainsi que les conséquences fonctionnelles de ces mutations de résistance vis-à-vis de la liaison et de l’activité PPIase de la CypA. L’alisporivir est un analogue non immunosuppresseur de la CsA actuellement en phase III de développement clinique. Nous avons analysé par cristallographie des rayons X la structure du complexe CypA-alisporivir permettant d’apporter une explication moléculaire au caractère non immunosuppresseur de cette molécule. Grâce à l’utilisation de deux stratégies de marquage de NS5A-D2 au fluor, nous avons caractérisé par RMN l’interaction moléculaire entre les protéines NS5A-D2 et NS5B, l’ARN-dépendante ARN polymérase du VHC. NS5A-D2 interagit avec l’Hexokinase 2 humaine, la première enzyme limitante de la glycolyse, cette interaction augmente l’activité enzymatique de l’HK2. Nous nous sommes intéressés aux relations structurales et fonctionnelles entre NS5A-D2 et HK2. Ces résultats apportent un nouvel éclairage sur le rôle de NS5A-D2 dans la réplication du VHC.
Hepatitis C Virus (HCV) is a positive strand RNA virus that has infected more than 130 million people worldwide. Cyclophilin inhibitors hold promise as a novel anti-HCV therapy. The host protein Cyclophilin A (CypA) plays an essential role in HCV RNA replication but its molecular function is unknown. The HCV protein NS5A (in its domain 2, NS5A-D2) has been shown to be implicated in the action of CypA as resistance mutations appeared in this domain under low doses of Cyclosporine A (CsA), the well-known CypA inhibitor with anti-HCV properties. NS5A is still an enigmatic multifunctional protein poorly characterized at the molecular level. This protein is strictly required for viral RNA replication but its precise molecular function(s) remain(s) to be elucidated. Its disordered domain 2 directly interacts with host CypA and is a substrate for the peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity of CypA. The binding site onto NS5A-D2 corresponds to the most conserved region of the domain. In this region a mutation D316E has been shown to confer CsA resistance. In this work we identified by NMR spectroscopy a short structural motif including this particular position in the otherwise disordered NS5A-D2, and report its structure. We show that this structural motif is essential for HCV RNA replication. In addition, we analyze the structural consequences of the resistance mutation to CypA inhibitors, and the functional consequences of these mutation regarding the binding and PPIase activity of CypA. Alisporivir in a non-immunosuppressive analogue of CsA with anti-HCV activity currently evaluated in phase III clinical trials, we analyzed by X-ray crystallography the structure of the CypA-Alisporivir complex in order to provide a molecular explanation for its non-immunosuppressive character. We also describe the interaction between NS5A-D2 and the HCV RNA dependent RNA polymerase NS5B. We use two different strategies to incorporate a 19F nucleus in NS5A-D2 and explore the use of 19F NMR to monitor the interaction between NS5A-D2 and NS5B. We also investigated the structural and functional relationship between NS5A-D2 and the human Hexokinase 2 (HK2), the first rate limiting enzyme of glycolysis. NS5A-D2 interacts with HK2 and this interaction is sufficient to increase HK2 activity. These results shed new light on the mechanisms by which NS5A-D2 contributes to the HCV replication cycle.
Le Virus de l’Hépatite C (VHC) est un virus à ARN de polarité positive infectant plus de 130 millions de personnes dans le monde. Les inhibiteurs de Cyclophilines sont prometteurs en tant que nouvelles molécules thérapeutiques contre l'infection par le VHC. La Cyclophiline A, une protéine de l’hôte, joue un rôle essentiel pour la réplication de l’ARN viral mais sa fonction reste à élucider. La protéine non structurale du VHC NS5A (et plus particulièrement son domaine 2, NS5A-D2) est impliquée dans le mécanisme d’action de la CypA, étant donné que des mutations de résistances apparaissent dans ce domaine sous pression de sélection à la Cyclosporine A (CsA), l’inhibiteur connu de la CypA possédant une activité anti-VHC. NS5A est une protéine multifonctionnelle faiblement caractérisée au niveau moléculaire. Cette protéine est strictement requise pour la réplication de l’ARN viral mais ses fonctions moléculaires précises restent à élucider. Le domaine 2 désordonné de NS5A interagit directement avec la CypA et constitue un site substrat pour l’activité peptidyl-prolyl cis/trans isomérase de la CypA. Le site d’interaction au niveau de NS5A-D2 correspond à la région la plus conservée du domaine. Dans cette région la mutation D316E confère une résistance à la CsA. Au cours de ce travail, nous avons identifié et caractérisé par RMN un petit motif structural au sein de NS5A-D2 localisé au niveau de cette région particulière. Nous montrons que ce petit motif structural est essentiel pour la réplication de l’ARN du VHC. Nous avons également analysé les conséquences structurales des mutations de résistances aux inhibiteurs de Cyclophiline A, ainsi que les conséquences fonctionnelles de ces mutations de résistance vis-à-vis de la liaison et de l’activité PPIase de la CypA. L’alisporivir est un analogue non immunosuppresseur de la CsA actuellement en phase III de développement clinique. Nous avons analysé par cristallographie des rayons X la structure du complexe CypA-alisporivir permettant d’apporter une explication moléculaire au caractère non immunosuppresseur de cette molécule. Grâce à l’utilisation de deux stratégies de marquage de NS5A-D2 au fluor, nous avons caractérisé par RMN l’interaction moléculaire entre les protéines NS5A-D2 et NS5B, l’ARN-dépendante ARN polymérase du VHC. NS5A-D2 interagit avec l’Hexokinase 2 humaine, la première enzyme limitante de la glycolyse, cette interaction augmente l’activité enzymatique de l’HK2. Nous nous sommes intéressés aux relations structurales et fonctionnelles entre NS5A-D2 et HK2. Ces résultats apportent un nouvel éclairage sur le rôle de NS5A-D2 dans la réplication du VHC.
Hepatitis C Virus (HCV) is a positive strand RNA virus that has infected more than 130 million people worldwide. Cyclophilin inhibitors hold promise as a novel anti-HCV therapy. The host protein Cyclophilin A (CypA) plays an essential role in HCV RNA replication but its molecular function is unknown. The HCV protein NS5A (in its domain 2, NS5A-D2) has been shown to be implicated in the action of CypA as resistance mutations appeared in this domain under low doses of Cyclosporine A (CsA), the well-known CypA inhibitor with anti-HCV properties. NS5A is still an enigmatic multifunctional protein poorly characterized at the molecular level. This protein is strictly required for viral RNA replication but its precise molecular function(s) remain(s) to be elucidated. Its disordered domain 2 directly interacts with host CypA and is a substrate for the peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity of CypA. The binding site onto NS5A-D2 corresponds to the most conserved region of the domain. In this region a mutation D316E has been shown to confer CsA resistance. In this work we identified by NMR spectroscopy a short structural motif including this particular position in the otherwise disordered NS5A-D2, and report its structure. We show that this structural motif is essential for HCV RNA replication. In addition, we analyze the structural consequences of the resistance mutation to CypA inhibitors, and the functional consequences of these mutation regarding the binding and PPIase activity of CypA. Alisporivir in a non-immunosuppressive analogue of CsA with anti-HCV activity currently evaluated in phase III clinical trials, we analyzed by X-ray crystallography the structure of the CypA-Alisporivir complex in order to provide a molecular explanation for its non-immunosuppressive character. We also describe the interaction between NS5A-D2 and the HCV RNA dependent RNA polymerase NS5B. We use two different strategies to incorporate a 19F nucleus in NS5A-D2 and explore the use of 19F NMR to monitor the interaction between NS5A-D2 and NS5B. We also investigated the structural and functional relationship between NS5A-D2 and the human Hexokinase 2 (HK2), the first rate limiting enzyme of glycolysis. NS5A-D2 interacts with HK2 and this interaction is sufficient to increase HK2 activity. These results shed new light on the mechanisms by which NS5A-D2 contributes to the HCV replication cycle.
04-11-2019
04-11-2019
Thèse
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Epigenetic mechanisms and post-translational modifications play a key role in the cell cycle regulation of Alphaproteobacteria
Epigenetic mechanisms and post-translational modifications play a key role in the cell cycle regulation of Alphaproteobacteria


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Chez l’organisme modèle Caulobacter crescentus, de nombreux régulateurs sont impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. Dans ce travail, nous présentons la découverte de l’interaction fonctionnelle entre GcrA et la N6-adenosine méthyltransférase CcrM. La combinaison d’expériences de biochimie, de biophysique, d’immuno-précipitation de la chromatine et de génétique nous a permis de révéler que GcrA est une protéine dimérique qui se fixe à l’ADN, et qui montre une affinité préférentielle, à la fois in vitro et in vivo, pour les promoteurs qui ont été méthylés. Nous avons montré que le complexe GcrA/promoteur recrute l’ARN polymérase. Comme ce processus est également observée avec les orthologues de GcrA présents chez d’autres Alphaproteobacteria, nous avons conclu que GcrA est le membre d’une nouvelle classe de régulateurs transcriptionnels. Enfin, nous avons découvert que GcrA interagit également avec une protéine récemment caractérisée et appelée GipX. Une protéine essentielle, qui pourrait jouer un rôle dans la régulation de l’activité de GcrA et dans la biosynthèse de la paroi bactérienne. Enfin, concernant l’étude du phospho-relai responsable de l’activation du principal régulateur CtrA, nous décrivons également la structure protéique de ChpT ainsi que le développement d’un biosenseur capable de détecter les niveaux de phosphorylation in vivo. Ce biosenseur utilise le FRET et est basé sur la capacité des régulateurs de réponses à se dimériser lorsqu’ils sont phosphorylés. Ces résultats ouvrent la possibilité d’utiliser cette méthode pour l’étude de la phosphorylation des régulateurs de réponse dans d’autres modèles bactériens.
In model organism Caulobacter crescentus many regulators are involved in the control of cell cycle progression. In this thesis we present the discovery of the interaction between the cell cycle regulator GcrA and the N6-adenosine methyltransferase. Using a combination of ChIP-Seq biochemical and biophysical experimentation and genetics we showed that GcrA is a dimeric DNA-binding protein that targets promoters with CcrM methylation sites. We showed that the complex GcrA/promoter recruits the RNA polymerase. Since methylation-dependent DNA-binding is also observed with GcrA orthologs from other Alphaproteobacteria, we conclude that GcrA is a member of a new class of transcriptional regulators that function as molecular effectors of a methylation-dependent epigenetic switch that regulates gene expression. We discovered that GcrA is also able to interact with a newly characterized protein, named GcrA Interacting Protein X (GipX), that has an essential role in Caulobacter and that may play a role in the regulation of GcrA activity and cell wall metabolism. Regarding the phosphorelay that drives to the activation of the master regulator CtrA, the structure of ChpT, the factor together with CckA responsible for CtrA phosphorylation, was solved. A biosensor able to detect the phosphorylation level of CtrA in vivo is also described in this thesis. This sensor based on FRET exploits the ability of response regulators to dimerize upon phosphorylation. These results open the possibility to use this method to study the phosphorylation of response regulators in other bacterial systems.
Chez l’organisme modèle Caulobacter crescentus, de nombreux régulateurs sont impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. Dans ce travail, nous présentons la découverte de l’interaction fonctionnelle entre GcrA et la N6-adenosine méthyltransférase CcrM. La combinaison d’expériences de biochimie, de biophysique, d’immuno-précipitation de la chromatine et de génétique nous a permis de révéler que GcrA est une protéine dimérique qui se fixe à l’ADN, et qui montre une affinité préférentielle, à la fois in vitro et in vivo, pour les promoteurs qui ont été méthylés. Nous avons montré que le complexe GcrA/promoteur recrute l’ARN polymérase. Comme ce processus est également observée avec les orthologues de GcrA présents chez d’autres Alphaproteobacteria, nous avons conclu que GcrA est le membre d’une nouvelle classe de régulateurs transcriptionnels. Enfin, nous avons découvert que GcrA interagit également avec une protéine récemment caractérisée et appelée GipX. Une protéine essentielle, qui pourrait jouer un rôle dans la régulation de l’activité de GcrA et dans la biosynthèse de la paroi bactérienne. Enfin, concernant l’étude du phospho-relai responsable de l’activation du principal régulateur CtrA, nous décrivons également la structure protéique de ChpT ainsi que le développement d’un biosenseur capable de détecter les niveaux de phosphorylation in vivo. Ce biosenseur utilise le FRET et est basé sur la capacité des régulateurs de réponses à se dimériser lorsqu’ils sont phosphorylés. Ces résultats ouvrent la possibilité d’utiliser cette méthode pour l’étude de la phosphorylation des régulateurs de réponse dans d’autres modèles bactériens.
In model organism Caulobacter crescentus many regulators are involved in the control of cell cycle progression. In this thesis we present the discovery of the interaction between the cell cycle regulator GcrA and the N6-adenosine methyltransferase. Using a combination of ChIP-Seq biochemical and biophysical experimentation and genetics we showed that GcrA is a dimeric DNA-binding protein that targets promoters with CcrM methylation sites. We showed that the complex GcrA/promoter recruits the RNA polymerase. Since methylation-dependent DNA-binding is also observed with GcrA orthologs from other Alphaproteobacteria, we conclude that GcrA is a member of a new class of transcriptional regulators that function as molecular effectors of a methylation-dependent epigenetic switch that regulates gene expression. We discovered that GcrA is also able to interact with a newly characterized protein, named GcrA Interacting Protein X (GipX), that has an essential role in Caulobacter and that may play a role in the regulation of GcrA activity and cell wall metabolism. Regarding the phosphorelay that drives to the activation of the master regulator CtrA, the structure of ChpT, the factor together with CckA responsible for CtrA phosphorylation, was solved. A biosensor able to detect the phosphorylation level of CtrA in vivo is also described in this thesis. This sensor based on FRET exploits the ability of response regulators to dimerize upon phosphorylation. These results open the possibility to use this method to study the phosphorylation of response regulators in other bacterial systems.
04-11-2019
04-11-2019
Thèse
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