Élucidation des processus de lignification par la stratégie du rapporteur chimique alliée à la microscopie confocale en fluorescence et à la résonance paramagnétique électronique
(Elucidation of lignification process by chemical reporter strategy combined with confocal fluorescence microscopy and electron paramagnetic resonance spectroscopy)

URL d'accès : http://ori-nuxeo.univ-lille1.fr/nuxeo/site/esupver...

Auteur(s):  Simon, Clémence
Date de soutenance : 23/10/2019
Éditeur(s) : Université Lille1 - Sciences et Technologies 

Langue : Français
Directeur(s) de thèse :  Biot, Christophe ; Vezin, Hervé ; Lion, Cédric
Laboratoire : Unité de glycobiologie structurale et fondamentale (UGSF)
Ecole doctorale : École doctorale de Biologie-Santé (Lille)

Classification : Sciences de la vie, biologie, biochimie
Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Mots-clés : Stratégie du rapporteur chimique
Lignine -- Synthèse -- Métabolisme
Microscopie confocale
Sondes fluorescentes
Chimie bioorthogonale
Spectroscopie de résonance paramagnétique électronique

Résumé : La lignine est un polymère polyphénolique présent au niveau de la paroi végétale, qui forme avec la cellulose la biomasse lignocellulosique. Cette dernière est impliquée dans de nombreux processus industriels (biocarburant, pâte à papier, etc.). Une meilleure compréhension de sa biosynthèse est donc nécessaire pour améliorer la valorisation de la biomasse. La lignine est composée de trois principaux monomères appelés monolignols (H, G et S) qui sont assemblés par un couplage radicalaire initié par des laccases et/ou peroxydases lors de la lignification. L’émergence récente de la stratégie du rapporteur chimique bioorthogonal apparait comme une technique idéale pour étudier les processus de lignification. Dans cette stratégie, un analogue de la biomolécule d’intérêt modifié avec une étiquette chimique biocompatible est incorporé dans la biomacromolécule cible via les voies métaboliques. Il est ensuite couplé à une sonde grâce à une réaction chimique bioorthogonale pour être détecté. Ces travaux de thèse présentent le développement d’outils chimiques basés sur la stratégie du rapporteur chimique afin d’étudier les processus de lignification. Une stratégie inédite de triple marquage a été mise au point pour étudier la dynamique de lignification dans la paroi végétale par microscopie confocale de fluorescence. Des analogues portant des groupements méthylcyclopropène, azoture, et alcyne ont été conçus pour chaque monolignol (S, H et G respectivement) et ont été incorporés simultanément dans la lignine de novo. Ces analogues ont ensuite été liés sélectivement à un fluorophore par des réactions de ligation bioorthogonale spécifiques lors d’un triple marquage séquentiel (DAinv, SPAAC et CuAAC respectivement). La microscopie confocale de fluorescence a permis de visualiser leur incorporation différentielle dans la lignine et d’obtenir des informations sur la dynamique de lignification chez différents systèmes végétaux (sections de tiges et de racines, tiges entières, etc.) et chez différentes espèces végétales (lin, Arabidopsis thaliana, peuplier, etc.). De plus, le triple marquage a pu être réalisé avec deux types de biomolécules pour visualiser la biosynthèse simultanée de la lignine avec des polysaccharides non cellulosiques. Un second axe de recherche novateur a été initié afin de valider l’incorporation métabolique d’un analogue de monolignol dans les tissus végétaux et sa détection à l’aide d’une sonde radicalaire par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique. Cette nouvelle méthodologie pourra à terme fournir des informations sur la structure, la concentration et l’environnement de la sonde incorporée détectant spécifiquement la lignine de novo.


Résumé (anglais) : Lignin is a phenolic polymer of plant cell wall which forms with cellulose the lignocellulosic biomass, involved in a variety of industrial applications (biofuel, paper making, etc.). A better understanding of its formation within plant cell walls is needed to improve the valorization of this biomass. Lignin is mainly composed of three monomers called monolignols (H, G and S) that are assembled by a radicalar polymerization process initiated by laccases and/or peroxydases during lignification. The recent emergence of the bioorthogonal chemical reporter strategy appears as a powerful tool to study lignification processes. In this strategy, an analogue of the biomolecule of interest modified with a biocompatible chemical tag is metabolically incorporated into the target biomacromolecule. It is then detected by fluorophore tagging initiated by a bioorthogonal chemistry reaction. The current work presents the development of chemical tools based on the chemical reporter strategy for the study of lignification process. A novel triple labeling strategy has been developed to study lignification dynamics in plant cell wall by confocal fluorescence microscopy. Analogs bearing methylcyclopropenyl-, azido-, and alkynyl tags were synthesized for each monolignol (S, H and G respectively) and incorporated into the de novo lignin. These analogs were then selectively linked to a fluorophore by a specific bioorthogonal ligation reaction during a sequential triple labeling (DAinv, SPAAC, and CuAAC respectively). Fluorescence confocal microscopy allowed visualization of their differential incorporation into lignin. It gave informations about lignification dynamics in different plant systems (stem and root cross sections, whole stems, etc.) and to various plant species (flax, Arabidopsis thaliana, poplar, etc.). In addition, this triple labeling could be done with two types of biomolecules to simultaneously monitor the biosynthesis of lignin and non-cellulosic polysaccharides. A second innovative research axis was initiated to validate the metabolic incorporation of a monolignol analog in plant tissues with its detection using a radical probe by electronic paramagnetic resonance spectroscopy. This new methodology could ultimately provide informations about the structure, concentration and environment of the incorporated probe specifically by detection of de novo lignin.


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