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Élucidation des processus de lignification par la stratégie du rapporteur chimique alliée à la microscopie confocale en fluorescence et à la résonance paramagnétique électronique

/ Simon Clémence / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 23-10-2019
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La lignine est un polymère polyphénolique présent au niveau de la paroi végétale, qui forme avec la cellulose la biomasse lignocellulosique. Cette dernière est impliquée dans de nombreux processus industriels (biocarburant, pâte à papier, etc.). Une meilleure compréhension de sa biosynthèse est donc nécessaire pour améliorer la valorisation de la biomasse. La lignine est composée de trois principaux monomères appelés monolignols (H, G et S) qui sont assemblés par un couplage radicalaire initié par des laccases et/ou peroxydases lors de la lignification. L’émergence récente de la stratégie du rapporteur chimique bioorthogonal apparait comme une technique idéale pour étudier les processus de lignification. Dans cette stratégie, un analogue de la biomolécule d’intérêt modifié avec une étiquette chimique biocompatible est incorporé dans la biomacromolécule cible via les voies métaboliques. Il est ensuite couplé à une sonde grâce à une réaction chimique bioorthogonale pour être détecté. Ces travaux de thèse présentent le développement d’outils chimiques basés sur la stratégie du rapporteur chimique afin d’étudier les processus de lignification. Une stratégie inédite de triple marquage a été mise au point pour étudier la dynamique de lignification dans la paroi végétale par microscopie confocale de fluorescence. Des analogues portant des groupements méthylcyclopropène, azoture, et alcyne ont été conçus pour chaque monolignol (S, H et G respectivement) et ont été incorporés simultanément dans la lignine de novo. Ces analogues ont ensuite été liés sélectivement à un fluorophore par des réactions de ligation bioorthogonale spécifiques lors d’un triple marquage séquentiel (DAinv, SPAAC et CuAAC respectivement). La microscopie confocale de fluorescence a permis de visualiser leur incorporation différentielle dans la lignine et d’obtenir des informations sur la dynamique de lignification chez différents systèmes végétaux (sections de tiges et de racines, tiges entières, etc.) et chez différentes espèces végétales (lin, Arabidopsis thaliana, peuplier, etc.). De plus, le triple marquage a pu être réalisé avec deux types de biomolécules pour visualiser la biosynthèse simultanée de la lignine avec des polysaccharides non cellulosiques. Un second axe de recherche novateur a été initié afin de valider l’incorporation métabolique d’un analogue de monolignol dans les tissus végétaux et sa détection à l’aide d’une sonde radicalaire par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique. Cette nouvelle méthodologie pourra à terme fournir des informations sur la structure, la concentration et l’environnement de la sonde incorporée détectant spécifiquement la lignine de novo.

Relations, interactions et fonctions des protéines alternatives

/ Cardon Tristan / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 10-10-2019
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Si en transcriptomique le dogme accepté par la communauté veut qu’un ARNm code pour une protéine unique, la protéomique vient de montrer l’inverse. Force de constater que les ARNm peuvent traduire plusieurs protéines. Celles ne suivant pas le cadre de référence sont appelées protéines alternatives (AltProts) et forme le protéome caché ou fantôme. Ces AltProts nécessitent la mise en place de stratégies adaptées pour leur mise en évidence. Leurs caractéristiques physicochimiques spécifiques, telles que leur petite taille permet d’adapter les méthodes classiques de protéomique à leur étude. Dans cet objectif la mise en évidence des AltProts par différentes méthodes d’extraction, notamment adaptées des méthodes de peptidomique, a permis de mettre en évidence les conditions d’enrichissement avant une analyse bottom-up. Ces AltProts sont une nouvelle classe de protéines pour laquelle très peu d’informations fonctionnelle sont connues. Les prédictions de fonction avancées lors des premières constructions de base de données, annonçaient des fonctions dans la régulation des ARN, de la synthèse de protéines et de la régulation d’expression des gènes par association avec des facteurs de transcriptions. Ces prédictions étaient basées sur les homologies de séquences entre les AltProts et les protéines de références (RefProts). Cependant très peu d’études montrent le rôle de ces protéines de manière expérimentale. Afin de mettre en évidence les fonctions de ces AltProts, nous avons choisi de retrouver leurs partenaires d’interaction. À l’heure actuelle, plusieurs méthodes existent permettant d’étudier l’interactome des protéines, toutefois la majorité est dirigée vers une cible, nécessitant parfois des constructions biochimiques ou l’utilisation d’anticorps dirigés, rendant ces méthodes difficiles à mettre en place pour les AltProts. Seule la méthode de Crosslink couplée à la spectrométrie de masse (XL-MS) permet d’observer des interactions cellulaires de manière non ciblée. Cette méthode de pontage chimique, bien que connaissant ses propres limitations, est applicable à la recherche des partenaires d’interaction des AltProts. Cet outil, associé aux logiciels de traitement des réseaux d’interaction, enrichi par les interactions connues entre RefProts dans la littérature, permet de replacer les AltProts dans ces réseaux. Ces réseaux, peuvent ensuite être traités afin de mettre en évidence les voies de signalisation impliquant les RefProts et ainsi déduire les différentes voies de signalisation associées aux AltProts observées crosslinkées aux RefProts.

NMR study of 14-3-3 protein-protein interactions and modulation thereof by small molecules

/ Seco Martins Marques Neves João Filipe / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 02-10-2019
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Les protéines 14-3-3 sont des protéines adaptatrices qui exercent leurs fonctions biologiques en modulant l’activité de centaines d’autres protéines. De part leur impressionnant interactome, les protéines 14-3-3 sont des acteurs qui influencent de nombreux événements cellulaires et, par conséquent, de maladies associées. La stabilisation ou l’inhibition sélective d’interactions protéine-protéine (IPP) de 14-3-3 sont considérées comme des approches prometteuses pour trouver des thérapies innovantes contre des maladies comme la maladie d’Alzheimer, certains cancers ou la maladie de Parkinson. Notre premier but afin de trouver des petites molécules capables de moduler ces cibles a été d’étudier au niveau moléculaire des IPP de 14-3-3. Dans ce but, nous avons utilisé la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) pour attribuer les déplacements chimiques des atomes du squelette de 14-3-3σ. Nous avons ensuite étudié l’interaction entre 14-3-3 et la protéine Tau phosphorylée. Nous avons découvert que Tau se lie strictement dans la cavité amphipathique de 14-3-3 et peut s’ancrer aux deux monomères du dimère de 14-3-3. Nous avons aussi étudié l’interaction 14-3-3/p53 et avons découvert, en utilisant la RMN, que l’affinité du peptide p53 envers 14-3-3 est liée à des interactions intramoléculaires au niveau du peptide. Nous nous sommes enfin focalisés sur l’optimisation d’expériences RMN visant le criblage et la caractérisation de l’activité des petites molécules qui se lient à 14-3-3 ou à des complexes de 14-3-3 avec des peptides phosphorylés. Nous avons aussi utilisé des peptides phospho-mimétiques pour inhiber l’interaction 14-3-3/Tau. D’autre part, nous avons criblé une bibliothèque de fragments contre 14-3-3σ et trouvé trois hits qui se lient à des régions différentes de la protéine. Des expériences RMN ont ensuite permis de caractériser l’activité de certaines petites molécules actives sur des complexes de 14-3-3 avec, par exemple des peptides de p53 ou p65, et nous avons aussi démontré la capacité de certains de ces composés à stabiliser les complexes.

Étude des microARNs dans les vésicules extracellulaires microgliales : signatures et neuroprotection

/ Lemaire Quentin / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 30-09-2019
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Dans le Système Nerveux Central (SNC), les cellules gliales influencent les activités neuronales. Les cellules microgliales, cellules immunitaires résidentes du SNC, contrôlent grandement l’état neuroinflammatoire. Ce contrôle est particulièrement important dans les fonctions physiologiques et s’avère souvent défectueux dans les neuropathologies. Les cellules microgliales sont en relation avec le microenvironnement cérébral et communiquent avec les autres types cellulaires (astrocytes, oligodendrocytes et neurones) afin de contrôler l’état neuroinflammatoire. Parmi les différents modes de communication intercellulaire au sein du SNC, les vésicules extracellulaires (VEs) interviennent largement dans les processus physiologiques (développement, homéostasie…) et pathologiques (maladies neurodégénératives…). C’est pourquoi, ce mode de communication a été étudié dans le dialogue entre la microglie et les neurones chez la sangsue Hirudo medicinalis. Cet annélide est un modèle intéressant de neurobiologie grâce à la structure linéaire de son système nerveux et à l’organisation de ses types cellulaires. Il permet l’étude du dialogue entre les cellules microgliales et les neurones au niveau d’une lésion expérimentale. Dans un premier temps, les résultats ont montré que les cellules microgliales interagissent avec les neurones lors d’une lésion du SNC et que des VEs sont libérées au niveau de cette lésion. De plus, les cellules microgliales produisent des VEs qui interagissent avec les neurones et délivrent un effet neurotrophique in vitro sur des neurones de sangsue et de rat. Dans un deuxième temps, la complexité des composés vésiculaires ainsi que des impératifs d’efficacité liés aux méthodes d’isolement nous ont conduits à développer l’analyse protéomique non ciblée et à grande échelle afin de valider les fractions positives en VEs mais aussi identifier leurs signatures protéiques biologiquement actives. Dans une dernière partie, nous nous sommes intéressés aux microARNs (miARNs) contenus dans les VEs microgliales. Les résultats ont permis l’identification de 6 miARNs dans les VEs microgliales, dont un seul, miR-146a, est décrit à ce jour dans le SNC chez les mammifères. Dans un contexte de dialogue neuroprotecteur entre VEs microgliales et neurones, les analyses neuronales ont prédit des ARNm potentiellement régulés par les miARNs contenus dans les VEs. Ces 6 miARNs ont également été identifiés dans les VEs issues de microglie de souris, de rat et humaine. Dans leur ensemble, les résultats montrent que les cellules microgliales chez la sangsue produisent des VEs, ayant un effet neurotrophique sur les neurones, y compris des neurones de rat. L’identification des molécules présentes dans ces VEs (protéines et miARNs) a permis de soulever des perspectives sur les mécanismes neuroprotecteurs supportant ce dialogue microglie-neurone qu’il sera intéressant d’examiner chez les mammifères dans un contexte de lésion nerveuse.

Nouvelles connaissances sur la régulation de la glycosylation complexe par O-GlcNAcylation dans des lignées coliques saines et cancéreuses

/ Biwi James Tapiwa / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 04-07-2019
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Le cancer colorectal (CCR) demeure un problème de santé publique majeur en Europe et plus généralement dans les sociétés occidentales. Le CCR est une pathologie dont les causes tiennent en partie d’un style de vie basé sur un régime alimentaire de type occidental et un mode de vie sédentaire. Cela implique par conséquent que le CCR soit associé à d’autres troubles métaboliques tels que l’obésité et le diabète. D’un consensus général on considère que le CCR est une maladie qui est mieux traitée si elle est dépistée relativement tôt ; malheureusement il n’existe toujours pas d’outils de diagnostic suffisamment fiables. A ce propos, différents types de glycosylation ont été proposés comme de potentiels biomarqueurs de cette maladie. Les travaux abordés dans cette thèse ont concerné l'influence de la O-GlcNAcylation (consistant en le transfert d'un seul monosaccharide de N-acétylglucosamine sur des résidus de sérine/thréonine de protéines cytoplasmiques, nucléaires et mitochondriales), sur la glycosylation complexe dans des lignées cellulaires coliques (HT29, HCT116 et CCD841CoN). La O-GlcNAcylation est intimement liée au statut nutritionnel, il est d’ailleurs proposé que son niveau soit plus élevé dans les pathologies métaboliques. Néanmoins il est clairement montré que les cellules et les tumeurs coliques expriment des niveaux plus élevés de O-GlcNAcylation. Plusieurs études ont montré que l’inhibition ou la délétion de la O-GlcNAc transférase (OGT), l’enzyme responsable des processus de O-GlcNAcylation, réduisait l'agressivité ou les propriétés associées au caractère tumoral dans différents modèles de cancer. Quelques études ont également montré que la sous-régulation de l’OGT se répercutait sur les glycosylations complexes : N- et O-glycanes, et glycosphingolipides (GSLs). La O-GlcNAcylation participe à des processus cellulaires clés tels que la transcription et la traduction. Dans une étude préliminaire, nous avons examiné les niveaux de transcrits de quatre-vingt-six glycosyltransférases et glycosidases dans des conditions de siOGT. Le siOGT a permis de constater que plusieurs de ces gènes étaient régulés positivement ou négativement, bien que parmi ces gènes seuls 10 étaient régulés négativement de manière significative. L'influence de l’OGT sur l’expression protéique de plusieurs glycosyltransférases a également été explorée. Nous avons ensuite utilisé plusieurs lectines en microscopie par fluorescence et en cytométrie en flux ainsi que la spectrométrie de masse (glycomique) afin d'élucider les structures complexes des glycanes et leur niveau d’expression dans les cellules coliques traitées par des siOGT. La diminution de O-GlcNAcylation n'a eu qu’un effet modéré sur les N- et O-glycanes globaux. Cependant, l'expression de plusieurs antigènes de surface a été modifiée par le siOGT. La E-cadhérine, un facteur majeur de la transition épithéliale-mésenchymateuse, a été régulée positivement dans les cellules HT29 traitées par le siOGT. De plus, les glycanes complexes portés par la E-cadhérine ont été eux-mêmes modifiés dans les cellules traitées par le siOGT. L'analyse MALDI des GSLs extraits de cellules HCT116 a révélé une altération significative de ces derniers dans les cellules siOGT, inversant le patron d’expression des GSLs décrits dans certaines cellules cancéreuses. Les GSLs des séries Globo, Gb3 et Gb4 ont été régulés à la hausse, tandis que les GSL gangliosidiques GM1a, GM2 et GD1a ont été régulés à la baisse. Cette étude démontre pour la toute première fois une relation entre la O-GlcNAcylation et les GSLs. Étant donné que les GSLs jouent un rôle important dans la reconnaissance cellulaire, la transduction du signal et d'autres propriétés de la surface cellulaire, ces observations pourraient expliquer en partir les changements phénotypiques liés au siOGT. De manière générale, une diminution de l’α2,3-sialylation est observée dans des conditions siOGT. Ces travaux sont les premiers à montrer un effet de la déplétion en OGT sur l’ensemble du glycome complexe, en particulier ceux s’exprimant à la surface des cellules.

Caractérisation de facteurs impliqués dans l’initiation et la morphogenèse des grains d’amidon chez Arabidopsis thaliana

/ Vandromme Camille / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 24-06-2019
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L’amidon est un composé permettant le stockage d’énergie et du carbone par les plantes, ce qui en fait un des polysaccharides les plus abondants sur Terre. Malgré nos connaissances sur le métabolisme de l’amidon, le processus d'initiation de la synthèse des grains d’amidon n’est pas décrit. La découverte de l’amidon-synthase 4 (SS4) en tant que protéine principalement impliquée dans le processus d’initiation de l’amidon, a permis de faire de grands progrès dans ce domaine. En effet, cette enzyme est impliquée dans le contrôle du nombre, de la forme et de la taille des grains d’amidon synthétisés dans les chloroplastes. La recherche de facteurs protéiques interagissant avec SS4 a conduit à la découverte d’un nouveau facteur protéique faisant l’objet principal de ce manuscrit. Cette protéine nommée PII1 (protéine impliquée dans l'initiation de l'amidon ; 90KDa) interagit avec SS4 dans le chloroplaste. L’analyse du phénotype amidon associé à son inhibition révèle l'implication de la protéine PII1 dans le mécanisme déterminant le nombre de grains d'amidon dans les feuilles d'Arabidopsis thaliana. Afin d’avoir un aperçu plus global des connexions qui relient les différents facteurs protéiques impliqués dans l’initiation de la synthèse de l’amidon, des lignées doubles mutantes ont été sélectionnées et caractérisées : ss3pii1, ss4pii1 et ss4phs1. Les résultats mettent en évidence le rôle spécifique de PII1 dans l'initiation de l'amidon par rapport aux amidon-synthases. Ils ont également permis de mettre en avant l'implication de la phosphorylase, dans l'initiation de l'amidon dans les tissus non-photosynthétiques.

Plasticité des réseaux de récepteurs membranaires dans la signalisation du NGF et de son précurseur dans les cancers du sein

/ Lévêque Romain / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 27-05-2019
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Le laboratoire INSERM U908 a montré le rôle déterminant du facteur de croissance NGF dans l’agressivité du cancer du sein. De précédentes études ont montré que l’inhibition de l’activité de TrkA, le récepteur du NGF, aboutissait à une diminution de la taille des tumeurs in vitro mais aussi dans des modèles pré-cliniques. Néanmoins, ces inhibiteurs ont donné lieu à des essais cliniques décevants. La résistance à ces inhibiteurs est en partie due à l’association de récepteurs membranaires. Plus précisément, mon travail de thèse a permis de démontrer qu’une forme particulière du récepteur CD44 interagit avec TrkA ce qui conduit à une résistance aux traitements. De plus, j’ai également montré l’existence d’une interaction entre TrkA et deux autres récepteurs. Ainsi, j’ai pu déterminer précisément comment ces récepteurs coopèrent afin de développer des inhibiteurs ciblant leur interaction. Ces inhibiteurs pourraient donc s’avérer efficaces pour le traitement de certains cancers du sein. Ma thèse souligne l’importance des complexes de récepteurs dans la plasticité des cellules cancéreuses et leur capacité à s’adapter pour résister aux thérapies ciblées.

Caractérisation des vésicules extracellulaires (VEs) d’origine microgliale et mise en évidence de leur effet neurotrophique

/ Arab Tanina / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 18-01-2019
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Les cellules microgliales sont considérées comme les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC). De nombreuses études ont démontré que ces cellules sont activées et recrutées sur le site de lésion. Les cellules microgliales de sangsue présentent un mode d’activation et de migration similaires post lésion expérimentale du SNC. Cette activation est accompagnée d'une libération massive de vésicules extracellulaires (VEs). Les VEs sont de petites particules produites par la plupart des types cellulaires et sont présentes dans plusieurs liquides biologiques, notamment la salive, l'urine, le lait maternel, le plasma et le liquide céphalo-rachidien ... Leur taille varie entre 30 nm et 1 µm de diamètre. Selon leur origine cellulaire, deux populations principales ont été décrites. Les exosomes qui sont connus comme des vésicules d'origine endosomales et les microvésicules qui sont générées suite au bourgeonnement de la membrane plasmique. Les travaux portent sur l'isolation de VEs libérées par des cellules microgliales en culture primaire. Chez la sangsue, ces dernières sont séparées des populations de neurones suite à la dissociation du SNC. Après quatre jours de culture, les VEs des cellules microgliales ont été isolées du milieu et leur contenu protéique a été analysé par spectrométrie de masse. D'autre part, les VEs isolées ont été également testées in vitro pour leur potentiel à induire une croissance neuritique à la fois sur les neurones de sangsue et des lignées cellulaires de neuroblastome de mammifères.

Implication de la signalisation ALK4/5 dans le dialogue entre les neurones et les cellules microgliales chez la sangsue Hirudo medicinalis

/ Raffo Romero Antonella / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 15-01-2019
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Dans le système nerveux central (SNC), toutes les activités neuronales sont sous l’influence des cellules gliales environnantes, incluant notamment les cellules microgliales. Ces cellules immunitaires résidentes du SNC régulent l’état neuroinflammatoire, si important dans les maladies neurodégénératives. Dans la microglie, les récepteurs du TGF-β de type I (ALK5) et de type II ont récemment été décrits comme une signature spécifique par rapport aux macrophages méningés ou infiltrants depuis le sang, permettant la maintenance/maturation de la microglie. Ces récepteurs sont également utilisés par les neurones en développement sous l'influence de membres de la famille TGF-β, incluant plusieurs GDFs (facteurs de croissance et de différenciation). C’est pourquoi, cette signalisation ALK4/5 a été étudiée dans le dialogue entre cellules microgliales et neurones chez la sangsue H. medicinalis. La sangsue médicinale est un modèle de neurobiologie qui, par sa structure nerveuse intéressante, offre la possibilité d’étudier les interactions entre sous-populations microgliales et neurones. Les résultats ont montré que les neurones et la microglie utilisent tous les deux la signalisation ALK4/5 dépendamment d’un membre de la famille TGF-β, appelé nGDF, pour maintenir des échanges mutuels après une lésion axonale. En effet, une libération neuronale immédiate de nGDF après une blessure axonale permet le recrutement précoce de microglie ALK4/5+ au point de la lésion tandis que, plus tardivement, la production de nGDF dans des cellules microgliales active de façon paracrine les neurones ALK4/5+. Ce second temps de dialogue permet aux neurones d’induire la production d'autres signaux chimiotactiques et ainsi maintenir l’accumulation de la microglie. Dans leur ensemble, les résultats permettent un nouvel aperçu de la compréhension de la voie ALK4/5 en tant que signal régulateur guidant une mobilisation chronologique correcte du recrutement de la microglie dans un cerveau adulte capable de régénération axonale. Les résultats ouvrent la perspective d’une telle étude chez les mammifères adultes afin de préciser la pertinence de ce dialogue dans le cerveau soumis à des lésions accidentelles ou pathologiques.

Effect of Nasopharyngeal Carcinoma derived exosomes on the induction of tolerogenic dendritic cells

/ Renaud Sarah / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 17-12-2018
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Le carcinome du nasopharynx (CNP) est un cancer des voies aérodigestives supérieures qui est associé à une infection par le virus d’Epstein Barr (EBV) dans près de 100% des cas. Le microenvironnement dans le CNP se caractérise par la présence massive de lymphocytes T régulateurs (Treg) et d’exosomes tumoraux (exoCNP) aux propriétés immunosuppressives. Notre équipe a montré que ces exosomes synergisent avec les Treg et contribuent à l’échappement à l’immunosurveillance du CNP. Notre hypothèse est que les exoCNP isolés de la tumeur puissent induire des cellules dendritiques (DC) tolérogènes qui favorisent la tolérance en induisant des Treg. Des premiers résultats dévoilent que les exoCNP favorisent l’émergence de DC semi-matures (smDC). Outre le phénotype, des études fonctionnelles de l’enzyme immunosuppressive indoléamine 2,3-dioxygénase 1 (IDO1) ainsi que de la sécrétion de cytokines régulatrices (IL-10 et TGF-β) montrent que les smDC générées mettent en place un microenvironnement immunosuppressif. Des résultats encourageants témoignent de l’activité tolérogène des smDC, capables d’induire des Treg fonctionnels et d’inhiber la prolifération des lymphocytes T effecteurs. Enfin, nous avons également montré que les exoCNP sont à même d’attirer préférentiellement les DC tolérogènes vers le site tumoral par la chimiokine CCL20. Nos résultats prometteurs semblent confirmer que les exoCNP induisent des DC tolérogènes contribuant à l’échappement immunitaire de la tumeur. Notre projet devrait ainsi ouvrir de nouvelles voies d’immunothérapies anti-tumorales ciblant des facteurs impliqués dans l’émergence des Treg et donc de la progression du cancer.

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