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Contribution et rôles dans la tumorigenèse des ARN non codants transcrits au locus H19/IGF2 : H19 et 91H

/ Vennin Constance / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 04-03-2016
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Le locus H19/IGF2 est soumis à l’empreinte génomique. A partir de l’allèle maternel, deux ARN non codants sont exprimés : H19 et 91H. L’ARN H19 est le précurseur de microARN (miR-675) dont aucune cible n’a été décrite dans la glande mammaire. Nous avons donc recherché et validé plusieurs cibles de ses microARN permettant d’expliquer les propriétés oncogéniques d’H19. En effet, le miR-675 régule l’expression des gènes c-Cbl, Cbl-b et FADD dans les cellules cancéreuses mammaires. Ces nouvelles régulations permettent l’augmentation de la prolifération cellulaire, la migration/invasion mais aussi la résistance aux apoptogènes. Dans cette étude, de manière inattendue et surprenante, nous avons également découvert un nouveau mécanisme de recrutement des microARN. Nous montrons que les protéines associées aux ARNm peuvent favoriser le recrutement du complexe RISC, mais surtout moduler l’action de celui-ci. De plus, dans certains cancers, l’ARN H19 peut s’associer aux protéines, notamment la protéine P53 dans les cancers gastriques, pour moduler leur fonction. Dans le cancer du sein, cette interaction empêche l’action de P53 et favorise sa dégradation. Cette nouvelle régulation de P53 peut être responsable de certaines résistances tumorales. Par ailleurs, l’implication d’H19 dans la formation et le maintien des cellules souches a été mise en évidence. Cette nouvelle fonction peut permettre à l’ARN H19 de promouvoir l’initiation ou la récidive tumorale. Les fonctions du long ARN non codant 91H dans les cellules cancéreuses mammaires ont également été étudiées. Cet ARN possède des propriétés oncogéniques et permet l’expression des gènes H19 et IGF2 en modulant la conformation de la chromatine au locus. Pour conclure, j’ai identifié plusieurs modes d’action de l’ARN H19 lui permettant de promouvoir l’apparition de la tumeur, sa progression et sa résistance aux thérapies. J’ai également défini le rôle de l’ARN 91H dans la tumorigenèse et au locus H19/IGF2.

Rôle des lymphocytes T régulateurs humains dans l'échappement de la maladie associée à l'infection par le virus de l'hépatite C

/ Ouaguia Laurissa / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 16-10-2015
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L’hépatite C est une pathologie hépatique caractérisée par un risque élevé de chronicité. Notre équipe a montré l’implication des lymphocytes T régulateurs naturels (Treg) et induits (iTreg) dans l’aggravation de cette pathologie. Cependant, l’impact direct du VHC sur ces 2 populations reste mal connu. Notre hypothèse est que le VHC pourrait aggraver l’environnement immunosuppresseur (i) en potentialisant le phénotype des Treg, (ii) en augmentant leur activité suppressive, (iii) en favorisant leur recrutement intra-hépatique et (iv) en induisant l’émergence d’iTreg. Dans la première partie de ma thèse, j’ai pu mettre confirmer une augmentation de la prévalence intrahépatique des Treg et des iTreg, corrélée à la progression de l’hépatite C vers le carcinome hépatocellulaire, chez un patient chroniquement infecté et suivi pendant 18 ans. Dans une deuxième partie, j’ai pu montrer que le VHC était capable (i) d’internaliser les Treg humains, (ii) de potentialiser leur phénotype régulateur, (iii) d’accroitre leur fonction suppressive, (iv) d’induire leur prolifération et la sécrétion de nombreux facteurs proinflammatoires, pouvant favoriser la chronicité de la maladie. Nous avons également suggéré que le VHC pourrait favoriser le recrutement intrahépatique des Treg. Dans la troisième partie, j’ai montré que le VHC favorisait l’émergence des iTreg, capables de supprimer la prolifération des cellules immunitaires, à partir des Tconv. Ces travaux montrent pour la première fois que le VHC pourrait favoriser l’instauration d’un microenvironnement immunosuppresseur et pourrait ainsi contribuer à la progression de la pathologie et à son l’échappement au système immunitaire.

Modifications post-traductionnelles de HIC1 et de BCL11 modulant le recrutement du complexe NuRD et mise en évidence de trois nouveaux gènes cibles directs de HIC1

/ Dubuissez Marion / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 05-10-2015
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La famille des protéines MTA (Metastasis Tumor Antigen) compte trois membres MTA1, 2 et 3 qui diffèrent au niveau de leur extrémité C-terminale, une région désorganisée. La région N-terminale est impliquée dans l’interaction avec le complexe corépresseur NuRD. NuRD est recruté par des facteurs de transcription au niveau de leurs gènes cibles pour réprimer la transcription. Les protéines HIC1 et BCL11 recrutent le complexe NuRD via les protéines MTA afin de réprimer leurs gènes cibles. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux modalités d’interactions entre les protéines HIC1 et BCL11 interagissant toutes deux avec l’extrémité C-terminale des protéines MTA. Dans ce cadre, nous avons montré que l’interaction HIC1-BCL11 ne semble pas jouer un rôle direct dans la régulation synergique de gènes cibles communs. Ensuite, nous avons montré que les protéines BCL11 interagissent avec les trois protéines MTA via leur motif N-terminal conservé MSRRKQ pour recruter différents complexes NuRD. De plus, la phosphorylation de la Sérine 2 de BCL11B médiée par PKC (Protein Kinase C) lors de l’activation des lymphocytes T CD4+, régule son activité de facteur de transcription. De plus, nous avons identifié CXCL12/SDF1 comme nouveau gène cible de HIC1 dans les lymphocytes T CD4+. Cette chimiokine est le ligand commun aux récepteurs CXCR4 et CXCR7 impliqués dans la migration et le « homing » des cellules de l’immunité. Enfin, nous avons également identifié deux nouveaux gènes cibles de HIC1 : ApoER2 et VLDLR codant tous deux des récepteurs à la Reelin. Cette voie de signalisation est impliquée dans la migration des précurseurs neuronaux lors du développement du cervelet.

Effets du clivage du récepteur tyrosine kinase Met par les calpaïnes sur la motilité et la mort cellulaire

/ Montagne Rémi / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 17-12-2014
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L’activation du récepteur tyrosine kinase Met par son ligand, l’Hépatocyte Growth Factor, induit des réponses cellulaires nécessaires au développement embryonnaire, comme la survie ou la migration. Cependant une dérégulation de sa signalisation favorise la tumorigenèse. Mon laboratoire a montré que le récepteur Met subit des clivages protéolytiques régulant son activité. Ainsi, le « PreSenilin-dependent Regulated Intramembrane Proteolysis », un double clivage par des métalloprotéases membranaires puis le complexe γ-sécrétase, contrôle sa demi-vie. Suite à un stress apoptotique, Met est clivé par les caspases en un fragment intracellulaire amplificateur d’apoptose. J’ai pu montrer que le récepteur Met est la cible d’une autre famille de protéases, les calpaïnes, qui réalisent deux clivages distincts en fonction du contexte cellulaire. En effet, la mutation R970C observée dans certains cancers ou une forte densité cellulaire induisent le clivage de Met en un fragment de 45 kDa, p45 Met, qui se relocalise dans le noyau et augmente la dispersion et la motilité cellulaire, suggérant un rôle dans la transformation cellulaire. D’autre part, lors d'un stress calcique induisant la nécrose, le récepteur Met est à la fois clivé par les calpaïnes et les métalloprotéases. Bien que les fragments générés ne semble pas amplifier la mort cellulaire, ce double clivage permet une dégradation efficace de Met et inhibe ainsi des signaux de survie transmis pas Met. L’ensemble de ces fragments est détecté dans des tumeurs pulmonaires surexprimant Met, indiquant que les clivages identifiés par notre laboratoire reflètent des mécanismes existant dans des conditions pathologiques.

Évaluation d’une stratégie d’immunothérapie peptidique antivirale dans le carcinome du nasopharynx associé au virus d’Epstein Barr : de l’expérimentation in vitro à la proposition de nouveaux essais thérapeutiques

/ Mrizak Dhafer / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 13-12-2013
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Le carcinome du nasopharynx (CNP) est associé à la latence II d’EBV et serait une cible préférentielle de peptides vaccinaux, dérivés des antigènes de latence II d’EBV, au sein d’une approche d’immunothérapie ciblant une réponse de type Th1. Cependant, les cellules de CNP sécrétaient des exosomes immunosuppresseurs qui induisent la mort des cellules T CD4+ Th1. En outre, cet environnement immunosuppressif est aggravé par un recrutement important de lymphocytes T régulateurs (Treg) qui sont associés à un mauvais pronostic dans le CNP. Ainsi, les objectifs de ma thèse ont consisté à (i) étudier l’impact des exosomes tumoraux de CNP (Exo-CNP) sur le phénotype et la fonctionnalité des Treg (ii) explorer les moyens de favoriser l’expansion et l’efficacité des effecteurs anti-tumoraux, notamment des lymphocytes T CD4+ Th1 anti-EBV, en proposant une stratégie d’immunothérapie peptidique. Dans la première partie, nous avons montré in vivo que la chimiokine CCL-20 était responsable du recrutement des Treg au sein de la tumeur. Par ailleurs, nous avons montré que les exosomes de CNP expriment la CCL-20 et sont capables de favoriser in vitro l’attraction des Treg via cette chimiokine. En parallèle, nous avons montré que les Exo-CNP (i) augmentent significativement l’expansion des Treg, (ii) augmentent significativement le niveau d’expression du CD25 et du FoxP3 sur les Treg, (iv) conduisent à la conversion des cellules T CD4+CD25neg en Treg CD4+CD25high. L’ensemble de ces résultats a été corrélé à une augmentation significative de l’activité suppressive des Treg en présence des exosomes de CNP. Dans la deuxième partie, nous avons validé ex vivo l’immunogénicité des peptides sur des cellules immunitaires humaines. Les résultats obtenus montrent également que des lignées T CD4+ humaines spécifiques d’EBV induisent une lyse des cellules de CNP EBV+. Et, de façon inattendue, la présence des Exo-CNP ne semble pas altérer les capacités de lyse des lignées. Enfin, nous avons pu valider l’efficacité des peptides dans un modèle in vivo. En effet, nous avons évalué l’effet anti-tumoral de la vaccination par les peptides dérivés d’EBV en mesurant l’évolution des masses tumorales. Nous avons pu montrer que la reconstitution immunitaire des souris SCID-CNP couplée à la vaccination peptidique permet la stabilisation de la croissance tumorale au cours du temps. En conclusion, la mise en évidence d’une coopération entre les Exo-CNP et les Treg est très importante et pourrait représenter ainsi un nouveau mécanisme d’échappement du CNP au système immunitaire. Par ailleurs, nos résultats consolident l’efficacité des peptides EBV qui pourraient être utilisés, à terme, dans une stratégie de vaccination peptidique ou de thérapie cellulaire en complément des traitements de référence chez les patients atteints d’un CNP.

Caractérisation du sécrétome des fibroblastes sénescents de derme humains et de son impact sur les étapes initiales de la carcinogenèse de la peau

/ Malaquin Nicolas / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 20-12-2012
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Bien que le risque de développer un carcinome augmente avec le vieillissement, la sénescence reste considérée comme un mécanisme suppresseur de tumeurs. Contrairement aux fibroblastes de derme, les kératinocytes primaires humains (NHEK) ne sont pas bloqués irréversiblement au plateau de sénescence in vitro. Une fraction de NHEK sénescents échappe à la mort et génère de nouvelles cellules néoplasiques. Le développement des cancers peut être stimulé par leur micro-environnement vieillissant pro-inflammatoire produit principalement par les fibroblastes sénescents. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser le sécrétome des fibroblastes sénescents de derme et d’en étudier l’impact sur l’émergence néoplasique des NHEK. Nous avons montré que les fibroblastes sénescents de derme produisent un sécrétome pro-inflammatoire : sécrétion de cytokines (MCP-1 ; IL-6), de facteurs de croissance (HGF/SF) et de métalloprotéases (MMP-1 ; -2…). Le conditionnement des cultures des NHEK par ce sécrétome des fibroblastes sénescents stimule la transition épithélium-mésenchyme et la migration des NHEK néoplasiques. Les MMP-1 et -2, sécrétées par les fibroblastes sénescents sont à l’origine des capacités migratoires de ces NHEK néoplasiques en activant leur récepteur à la thrombine PAR-1 (Proteases Activated Receptor), généralement associé aux stades tardifs. La caractérisation du sécrétome des fibroblastes sénescents par une analyse protéomique, montre aussi un défaut de sécrétion de plusieurs glycoprotéines de la matrice extracellulaire, aux propriétés anti-tumorales, provoqué par l’activation des voies de réponse au stress du réticulum endoplasmique associé à la sénescence.

Etude des propriétés apoptotiques du récepteur tyrosine kinase Met

/ Lefebvre Jonathan / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 16-12-2011
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Le récepteur Met et son ligand l’HGF/SF sont essentiels pour le développement embryonnaire tandis que la dérégulation de la signalisation du récepteur Met est associée à la progression tumorale. Activé par son ligand, Met induit un large panel de réponses biologiques telles que la survie cellulaire, la migration ou la prolifération. En revanche, le fragment p40 Met issu du clivage du récepteur par les caspases participe à l’apoptose. Cette dualité fonctionnelle est caractéristique de la famille des récepteurs à dépendance. Bien que la signalisation positive des RTK soit bien décrite, les mécanismes moléculaires leur permettant de participer aux processus de mort restent encore méconnus. Nous avons montré que le fragment p40 Met est capable d’amplifier l’apoptose indépendamment de l’activité kinase bien qu’il comprenne l’intégralité du domaine catalytique. Au cours de l’apoptose, nous avons montré à partir de lignées cellulaires épithéliales ou dans des foies de souris que p40 Met présente une localisation mitochondriale indispensable à ses fonctions apoptotiques. De manière intéressante, p40 Met possède au sein du site de fixation de l’ATP un domaine BH3 comparable à celui des protéines pro apoptotiques Bcl-2 de type BH3-only. A l’image des BH3-only, ce domaine est impliqué à la fois dans l’activité apoptotique du fragment et dans son association avec la protéine Bcl 2. Le fragment p40 Met est capable d’induire la perméabilisation mitochondriale independamment des caspases ce qui conduit au relargage du cytochrome c. Enfin, au cours de l’apoptose, l’extinction de l’expression de Met entraîne un retard du relargage du cytochrome c, démontrant ainsi la participation du récepteur dans la voie intrinsèque de l’apoptose.

An unanticipated role for the Phospholipase A2 receptor (PLA2R1) as a novel cellular senescence regulator and tumour suppressor gene

/ Augert Arnaud / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 30-09-2011
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Activée dans les stades précoces du développement tumoral, la sénescence empêche la progression tumorale en induisant un arrêt de prolifération cellulaire. Ainsi, tout comme l’apoptose, ce mécanisme doit être altéré pour qu’une cellule devienne tumorale. Malgré ce rôle crucial de protection contre la progression tumorale, nous connaissons peu les mécanismes moléculaires qui régulent l’échappement à la sénescence. A l’aide d’une banque de shRNA ciblant 8000 gènes, nous avons réalisé un criblage génétique dans le but d’isoler de nouveaux régulateurs, qui lors qu’ils sont inhibés, favorisent un échappement à la sénescence. Ce criblage nous a ainsi permis d’isoler PLA2R1 comme un nouveau régulateur de la sénescence. Nous avons montré que ce gène régulait la sénescence par l’activation du gène suppresseur de tumeurs p53. Un deuxième travail nous a ensuite permis d’identifier PLA2R1 comme un nouveau gène suppresseur de tumeurs. Dans un futur proche PLA2R1 pourra, peut-être, être utilisé comme bio-marqueur. De plus nous avons récemment démontré que cette protéine pourrait avoir un potentiel à visée thérapeutique étant donné son potentiel d’action sur les cellules tumorales. L’ensemble de ces travaux nous ont donc permis d’isoler PLA2R1 comme un nouveau régulateur de la sénescence et gène suppresseur de tumeurs.

Caractérisation de l'interaction fonctionnelle entre le produit du gène suppresseur de tumeurs HIC1 et les protéines de la famille Polycomb

/ Boulay Gaylor / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 29-09-2011
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HIC1 (Hypermethylated in Cancer 1) est un gène suppresseur de tumeurs inactivé dans de nombreux cancers par hyperméthylation de son promoteur ou par délétion chromosomique. HIC1 joue également un rôle au cours du développement. En son absence, les souris meurent autour de la naissance et présentent des défauts de développement observés chez l’Homme dans le Syndrôme de Miller- Dieker. La protéine HIC1 est un facteur de transcription possédant deux domaines de répression transcriptionnelle autonomes, son BTB/POZ N-terminal et sa région centrale, suivis de 5 doigts de zinc de type Krüppel C2H2 permettant sa fixation à une séquence d’ADN spécifique centrée sur un motif GGCA. Au cours de ma thèse, je me suis intéréssé aux mécanismes transcriptionnels mis en place par HIC1 afin de réprimer la transcription de ses gènes cibles. Dans ce cadre, nous avons étudié son interaction fonctionnelle avec les protéines de la famille Polycomb. HIC1 interagit avec hPCL3 et PHF1, deux protéines de la famille Polycomb-like, qui favorisent alors la formation d’un complexe avec les membres du PRC2. Les Polycomb sont retrouvés sur une partie des gènes cibles cibles de HIC1 et l’inhibition de HIC1 dans des fibroblastes embryonnaires entraîne la délocalisation partielle du PRC2 sur au moins un gène cible commun ATOH1. HIC1 est donc le premier facteur de transcription chez l’Homme capable de recruter les Polycomb-like. En parallèle de ce travail, nous avons étudié les caractéristiques de l’interaction entre les deux isoformes de hPCL3 et l’histone méthyl-transférase EZH2. Dans une dernière partie, nous avons mis en évidence de nouveaux gènes cibles de HIC1 impliqués dans la migration et l’invasion des cellules mammaires, deux mécanismes dérégulés dans les carcinomes en absence de HIC1. ADRB2 code un récepteur membranaire dont l’activation par l’adrénaline en conditions de stress est fortement impliqué dans la croissance tumorale et le processus de métastase dans les cancers du sein. En tant que gène suppresseur de tumeurs, la réexpression de HIC1 inhibe celle d’ADRB2 et impacte fortement la migration et l’invasion de cellules mammaires malignes.

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