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Microscopie linéaire et non linéaire pour étude de stress chez les copépodes

/ Ibrahim Ali / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 09-03-2015
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Les copépodes sont des petits crustacés de longueur autour de 1 mm en stade adulte. Leurs réponses à différents facteurs de stress tels que la salinité et la température peuvent être observées à différentes échelles d’organisation allant du gène, cellule jusqu’à l’organisme. Jusqu'à présent, aucune observation des effets de stress de température ou de salinité sur les copépodes n’a été faite par microscopie optique. Dans ce travail, nous avons mis en œuvre pour l'étude de ces copépodes les techniques de microscopie linéaire et non linéaires. D’abord avec la technique CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) nous avons pu étudier, caractériser et quantifier les effets de stress appliqués sur le copépode calanoïde Pseudodiaptomus marinus maintenu en culture pendant plusieurs générations dans le laboratoire à des conditions favorables et stables de salinité (30 psu) et de température (18 °C). Ces différents stress appliqués sont: une forte diminution de la température (18 à 4 ° C), des diminutions mineure et majeure de la salinité (de 30 respectivement à 15 PSU et à 0 PSU) et enfin, un stress mélangé d’une baisse simultané de la température et de la salinité (de 18 ° C et 30 psu à 4 ° C et 0 PSU). Nos observations ont été concentrées sur le muscle du copépode. Cette étude a été complétée par la technique SHG/TPEF qui nous a répondu à quelques questions à propos de la disparition des stries musculaires. Cette technique a été suivie par la technique de transformation de Fourier (FFT) appliquée sur les profils des stries musculaires pour mieux comprendre l’état des stries dans chaque stress. Enfin, nous avons appliqué la microscopie CARS qui a été développée dans notre laboratoire à l'imagerie de ces échantillons. Avec cette technique d’imagerie on a pu identifier les stries musculaires et les réserves lipidiques.

Functional nanoparticles for biological applications

/ Khanal Manakamana / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 27-10-2014
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Les nanoparticules fonctionnalisées continuent de susciter beaucoup d’interêt dans les applications biomédicales et les essais biologiques. Elles sont devenues un élément clé dans la recherche en nanobiotechnologie. Un des axes primordiaux des travaux de recherche est le développement de stratégies polyvalentes de fonctionnalisation de surface pour différentes nanoparticules allant de nanostructures de diamants à des nanoparticules d'oxyde de fer, des particules de silice et des nanocapsules lipidiques. Un des objectifs en particulier a été l’introduction de diverses fonctionnalisations sur les mêmes nanoparticules en utilisant soit des ligands dérivés de la dopamine ou soit par chimie « click » de Cu(I) catalysé. Il en résulte des nanostructures bien dispersées fonctionnalisées avec différents ligands à leurs surfaces. Les applications de ces nanostructures pour l'inhibition des infections virales et pour la délivrance de gènes ont été étudiées. En effet, l'inhibition de l'entrée du VHC a été identifiée comme étant une stratégie thérapeutique potentielle. Il a pu être démontré que différentes nanoparticules peuvent être efficacement conçues pour afficher les propriétés de lectine et se comporter donc comme des inhibiteurs efficaces d'entrée du virus in vitro. Les pseudo-lectines étudiées ici comprennent les nanoparticules dérivées du fer, de silice, du diamant et des nanocapsules lipidiques comportant toutes des fragments d’acide boronique attachés à leurs surfaces.Par ailleurs, le potentiel des nanoparticules de diamant pour la délivrance de gènes a été étudié.

Utilisation et développement de biosenseurs FRET pour la mesure d'actvités kinases in vivo au cours du cycle cellulaire

/ Vandame Pauline / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 09-10-2014
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L’implication et les rôles de la PKA et de la MAPK/ERK lors de la division cellulaire, ont fait l’objet de nombreuses études. Pourtant les profils spatio-temporels des activités de ces kinases au cours des différentes étapes du cycle et notamment lors de la mitose sont controversés et restent à éclaircir. Le but de ce travail a été la détermination de ces profils grâce à l’utilisation et au développement d’outils moléculaires basés sur des propriétés de la fluorescence, capables de rapporter l’activité kinase in vivo, qui sont appelés biosenseurs FRET. Nous avons mis en évidence que l’activité de PKA augmente lors de la mitose pour ensuite chuter rapidement lors de la cytokinèse dans les cellules HeLa. Lors de la métaphase et de l’anaphase, l'activité de PKA est particulièrement élevée à proximité des chromosomes et ce, indépendamment d’une relocalisation de ses sous-unités catalytiques. De plus, l’utilisation d’inhibiteur de PKA conduit à l’apparition de phénotypes mitotiques aberrants, indiquant le rôle essentiel de cette augmentation d’activité dans le maintien de l’intégrité du génome. Ces phénotypes sont similaires à ceux décrits pour des perturbations de l’activité de MAPK/ERK. Le développement d’un biosenseur FRET optimisé pour les mesures d’activité de MAPK/ERK nous a permis de déterminer que son activité globale ne varie pas lors de la mitose mais connait en revanche une diminution forte et très brève lors de la cytokinèse. L’inhibition de PKA induit une augmentation sensible de la phosphorylation de MAPK/ERK, ce qui pourrait suggérer ainsi un lien entre les activités de ces deux protéines dans la répartition correcte du matériel génétique lors de la mitose.

Epigenetic mechanisms and post-translational modifications play a key role in the cell cycle regulation of Alphaproteobacteria

/ Fioravanti Antonella / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 02-10-2014
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Chez l’organisme modèle Caulobacter crescentus, de nombreux régulateurs sont impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. Dans ce travail, nous présentons la découverte de l’interaction fonctionnelle entre GcrA et la N6-adenosine méthyltransférase CcrM. La combinaison d’expériences de biochimie, de biophysique, d’immuno-précipitation de la chromatine et de génétique nous a permis de révéler que GcrA est une protéine dimérique qui se fixe à l’ADN, et qui montre une affinité préférentielle, à la fois in vitro et in vivo, pour les promoteurs qui ont été méthylés. Nous avons montré que le complexe GcrA/promoteur recrute l’ARN polymérase. Comme ce processus est également observée avec les orthologues de GcrA présents chez d’autres Alphaproteobacteria, nous avons conclu que GcrA est le membre d’une nouvelle classe de régulateurs transcriptionnels. Enfin, nous avons découvert que GcrA interagit également avec une protéine récemment caractérisée et appelée GipX. Une protéine essentielle, qui pourrait jouer un rôle dans la régulation de l’activité de GcrA et dans la biosynthèse de la paroi bactérienne. Enfin, concernant l’étude du phospho-relai responsable de l’activation du principal régulateur CtrA, nous décrivons également la structure protéique de ChpT ainsi que le développement d’un biosenseur capable de détecter les niveaux de phosphorylation in vivo. Ce biosenseur utilise le FRET et est basé sur la capacité des régulateurs de réponses à se dimériser lorsqu’ils sont phosphorylés. Ces résultats ouvrent la possibilité d’utiliser cette méthode pour l’étude de la phosphorylation des régulateurs de réponse dans d’autres modèles bactériens.

Préparation et applications de plateformes à base de nanaoparticules d’or et de graphène

/ Kaminska Izabela / Université Lille1 - Sciences et Technologies, Instytut chemii fizycznej (Pologne) / 19-02-2014
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Dans ce travail de thèse, de nouvelles méthodes de préparation d’interfaces recouvertes de nanoparticules d’or (Au NPs) et/ou d’oxyde de graphène réduit (rGO) ont été développées. La méthode de dépôt des nanoparticules d’or repose sur la technique dite « three phase junction » ou « jonction à trois phases ». Différentes conditions de dépôt par voltampérométrie et chronoampérométrie ont été utilisées pour optimiser la taille et la forme ainsi que la stabilité de ces nanostructures sur l’électrode. Les propriétés catalytiques des électrodes modifiées par les nanostructures métalliques ainsi obtenues ont été exploitées pour l’oxydation du glucose et la réduction d’oxygène. Ces interfaces ont montré une activité catalytique comparable à celle décrite dans la littérature pour d’autres électrodes. Ces interfaces ont été aussi investiguées comme substrats pour la spectroscopie SERS et pour la microscopie en fluorescence. La deuxième partie de la thèse a porté sur la mise au point d’une méthode simple pour la réduction et la fonctionnalisation de feuillets de GO. Deux molécules aromatiques (la dopamine et le tétrathiafulvalène, TTF) ont été utilisées pour la préparation de matériaux nanocomposites : rGO/dopamine et rGO/TTF. Les nanocomposites obtenus ont été caractérisées par différentes techniques d’analyse de surfaces et mesures électrochimiques. Les applications potentielles de ces nanocomposites ont été démontrées dans le domaine de capteurs et interrupteurs chimiques. Finalement, l’influence des Au NPs et/ou de rGO ainsi synthétisées sur les propriétés de fluorescence de biomolécules a été investiguée sur des interfaces modifiées par ces nanoobjets.

Etudes structurales et fonctionnelles du système de sécrétion à deux partenaires HxuA/HxuB de Haemophilus influenzae

/ Baelen Stéphanie / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 13-12-2013
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Le système sécrétion de type V à deux partenaires ou système TPS est un système dédié à la sécrétion de protéines de grandes tailles souvent impliquées dans la virulence. La protéine sécrétée ou protéine TpsA traverse la membrane externe via son partenaire membranaire spécifique, la protéine TpsB. Ces systèmes TPS sont répartis en deux sous-familles, la sous-famille FHA/FhaC et la sous-famille HMW1A/HMW1B, peu caractérisée structuralement, à laquelle appartient le système HxuA/HxuB dédié à l’acquisition de l’hème extracellulaire chez Haemophilus influenzae. Ma thèse est consacrée à l’étude structurale et fonctionnelle du système HxuA/HxuB. A cette fin, le système de sécrétion HxuA/HxuB a été recréé chez E. coli. Le domaine N-terminal de HxuA, HxuA301, et son partenaire HxuB entier ont été produits respectivement en surnageant de culture et en membrane externe. Après purification de ces protéines, des essais de cristallogenèse ont été réalisés. Des cristaux ont été obtenus pour HxuA301 et HxuB. Seule la structure de HxuA301 a pu être déterminée avec une résolution de 1,5 Å. HxuA301 présente une structure en hélice-β main droite avec un motif extra-hélice constitué de quatre brins-β antiparallèles. Des croisements entre les systèmes HxuA/HxuB et HMW1A/HMW1B ont été réalisées et ont mis en évidence le fait que HxuB n’est pas indispensable au repliement de HxuA301. On a en effet pu résoudre la structure de HxuA301 produite dans E. coli sans HxuB (HxuA301-noB) qui est en tout point identique à celle de HxuA301. Cette observation appuie l’hypothèse selon laquelle le domaine N-terminal des protéines TpsA serve à initier le repliement progressif de la protéine TpsA une fois la surface bactérienne atteinte.

Carbon-based materials : preparation, functionalization and applications

/ Wang Qi / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 05-12-2013
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Le graphène et ses dérivées ont suscité un grand intérêt au fil des années en raison de leurs propriétés physiques et chimiques exceptionnelles. Pour l'intégration du graphène dans des dispositifs électrochimiques, il est essentiel d'avoir une technique simple, reproductible et contrôlable afin de produire des feuillets de graphène de bonne qualité sur des grandes surfaces. Dans cette optique, l'utilisation d'oxyde de graphène réduit chimiquement (rGO) plutôt que le graphène produit par la technique CVD représente une alternative très prometteuse. Dans cette thèse, nous avons développé différentes approches simples, respectueuses de l'environnement, et contrôlables pour la réduction chimique de l'oxyde de graphène en rGO ainsi que la fonctionnalisation simultanée de la matrice de rGO formée par les agents de réduction utilisés. Les divers agents réducteurs utilisés sont : la tyrosine, l'acide 4-aminophénylboronique (APBA), la dopamine portant une fonction alcyne, et nanoparticules de diamant (ND). Les matrices de rGO ainsi préparées ont été caractérisées par différentes méthodes telles que : XPS, AFM, MEB, FTIR, Raman, UV/Vis et mesures électrochimiques. Les matrices de rGO, déposées sur des électrodes de carbone vitreux (GC), ont ensuite été utilisées pour des applications électrochimiques pour la détection du peroxyde d'hydrogène (en absence d’enzyme), du glucose, et de la L-dopa et carbidopa simultanément. Finalement, les nanocomposites de rGO/NDs ont été utilisés avec succès comme électrodes dans des supercondensateurs, et ont montré une capacité spécifique de 186 F g-1 et une excellente stabilité.

Computer modeling of the application of mechanical forces to biomolecules

/ Singh Raghvendra Pratap / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 27-11-2013
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Dans les derniers 20 ans, les expériences de traction sur molécule unique par l’action d’une force mécanique ont donné plein d’informations autour des propriétés mécaniques des biomolécules, des modifications structurelles induites par des contraintes mécaniques, ainsi qu’éclaircir les mécanismes d’adhésion et décohésion des paires ligand-recepteur. Suivant cette analyse microscopique, outre que révéler des propriétés biologiques intéressantes, plusieurs de ces systèmes ont montré une nouvelle face, celle de nouveaux matériaux aux propriétés parfois uniques, et ont notamment induit des spéculations sur leur possibles utilisations dans des dispositif de nanotechnologie. Dans cette thèse, par le biais de simulations de dynamique moléculaire, notamment avec les méthodes dites “steered molecular dynamics” et “umbrella sampling”, nous avons réalisé des études concernant : (a) la caractérisation structurelle et mécanique de fragments d’ADN atypiques, comme le tétramère dénommé i-motif, ainsi que (b) la reconstruction des profils d’énergie libre de la liaison et dissociation entre des paires bromodomaine – queues d’histone acétylés (H3 et H4). Nous avons ainsi étudié la structure moléculaire de ces nanostructures particulières d’ADN, formées par l’intercalation de quatre brins d’ADN en un tétramère, et nous en avons déterminé pour la première fois les propriétés mécaniques de base : module de Young, module de flexion, longueur de persistance, et résistance mécanique. Dans la dernière partie du travail, nous avons étudié la manière d’appliquer ces mêmes méthodes à l’étude de paires ligand-recepteur dans le processus de transcription de l’ADN. Nous avons montré que les expériences simulées de traction, dans lesquelles la paire ligand-recepteur est séparée de manière contrôlée par une force mécanique aux extrémités, peuvent donner des informations sur l’hypersurface d’énergie libre. Nous avons essayé, avec un partiel succès, l’application au cas de l’interaction entre bromodomaines et queues d’histones, dans des conditions comparables aux expériences.

Contribution à la réalisation de dispositifs microfluidiques à base d’électromouillage pour la détection SPR

/ Perry Guillaume / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 17-12-2012
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Ces travaux de thèse ont porté sur l’étude de solutions originales pour limiter la biopollution dans des systèmes microfluidiques à base d'électromouillage (EWOD) couplés à un biocapteur à résonance de plasmons de surface (SPR). Deux approches complémentaires ont été étudiées. Dans un premier temps nous avons mis à profit la forte adsorption de protéines sur des nanofeuillets d'oxyde de graphène (GO): les caractérisations de mouillage de solutions contenant un mélange de GO et de protéines (albumine sérique bovine - BSA) ont permis de montrer que le GO maintenait en suspension les protéines en évitant leur adsorption sur la surface. Le résultat le plus remarquable obtenu concerne le déplacement par EWOD de BSA, à une concentration de 195ng/µL (pour 500ng/µL de GO), 30 fois plus que ce qu’il est possible de transporter sans GO. Nous avons montré que la présence des feuillets de GO n’altère pas l’activité enzymatique. Une autre solution a consisté à développer des surfaces superomniphobes (connues pour leur propriété d’auto-nettoyage) via un dépôt chimique de nanostructures d’oxyde de zinc (ZnO). Nous avons montré que certaines nanostructures de forme réentrante présentent des angles de contact supérieurs à 140°, des hystérésis inférieures à 20° pour des liquides de tensions de surface supérieures à 35mN/m. Pour finir, ces deux approches ont été validées pour l’application envisagée. L’interaction entre biomolécules et biodétecteur SPR a pu être validée (i) en contrôlant la désorption des protéines du GO par une solution basique, (ii) en réalisant des ouvertures dans les nanostructures de ZnO.

Détection d’interactions moléculaires par LSPR et utilisation de surfaces semi-conductrices pour la dégradation photocatalytique de polluants organiques sous irradiation visible

/ Barka-Bouaifel Fatiha / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 18-11-2012
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Dans cette thèse, deux applications de nanomatériaux sont présentées : la première concerne l’utilisation de la technique LSPR pour la détection d’interactions moléculaires et la seconde est consacrée à l’utilisation de surfaces semi-conductrices de TiO2 et de ZnO pour la photo-catalyse pour la dépollution environnementale. D’abord, nous avons présenté la préparation et la caractérisation d’interfaces plasmoniques d’ITO/Au NSs/ITO. Celles-ci montrent des signaux optiques aussi bien pour des couches minces qu’épaisses d’ITO. Elles permettent une détection LSPR à courte et à longue portée. La chimie « click » a été utilisée pour greffer le CBPQT4+ fonctionnalisé alcynyl sur une interface ITO/Au NSs/ITO terminée « azide ». Les interfaces obtenues ont été utilisées pour démontrer la possibilité d’enregistrer la formation et la rupture de complexes « hôte-invité » (CBPQT+4/TTF) utilisant la technique LSPR. Dans la seconde partie, consacrée à la photocatalyse, nous nous sommes intéressés à deux types de traitements de TiO2 et de ZnO dans le but d’améliorer leur efficacité photocatalytique sous irradiation visible. Nous avons, préparé et caractérisé des lames de quartz recouvertes d’une couche mince de TiO2 de différentes épaisseurs avec et sans nanostructures d’or sous la couche mince de TiO2. La performance photocatalytique de ces interfaces n’est pas exceptionnelle pour la dégradation de la rhodamine B mais elles sont très stables. La dernière partie de la thèse concerne la préparation et la caractérisation de nanostructures de ZnO et de ZnO dopé à l’iode. La substitution des ions d’oxygène par des ions d’iode introduit des niveaux donneurs dans la bande interdite de ZnO qui sont suffisamment superficiels à température ambiante. L’activation d’une transition, dans la bande interdite dans le cas des substrats de ZnO dopé à l’iode, explique les meilleures performances photocatalytiques de ces substrats de la rhodamine B sous irradiation visible. Ces résultats sont très prometteurs pour diverses applications photocatalytiques des substrats à base de ZnO.

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