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Development of On-Tissue Mass Spectrometric Strategies for Protein Identification, Quantification and Mapping

/ Quanico Jusal / Université Lille1 - Sciences et Technologies, Université de Sherbrooke / 11-07-2014
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L’imagerie par spectrométrie de masse est une technique sans marquage permettant la détection et la localisation de protéines à partir de coupes de tissus. Afin de répondre à des problématiques biologiques, le nombre de protéines identifiées doit être amélioré. Une stratégie consiste à réaliser une micro-jonction liquide sur des régions particulières des coupes de tissus afin d’extraire les peptides issus de la digestion in situ des protéines. Plus de 1500 protéines ont identifié sur une zone de 650µm, correspondant à environ 1900 cellules. Une corrélation entre ces données avec celles générées par MSI a augmenté le nombre de protéines localisées. Afin d’obtenir dans le même temps, la localisation et l’identification de protéines, une méthode consiste à réaliser la microdissection de l’ensemble de la coupe après l’avoir déposée sur une lame recouverte de parafilm. PAM a également été appliquée à l’étude de l'expression différentielle de protéines dans des tumeurs de prostate. Les résultats ont permis d’identifier des biomarqueurs potentiels tels que des protéines complexées avec des petits ARN nucléolaires. Enfin, la faisabilité des méthodes MS appliquées à l’étude structurale de protéines, tel que l'échange deutérium ou le pontage chimique, ont été examinés directement sur tissu. Les résultats préliminaires suggèrent qu’une étude structurale de protéines est possible afin de déterminer des changements de structures entrainés par la modification du microenvironnement. Réunis ensemble, ces méthodes MS d'analyses directes fournissent un moyen robuste d’étude de protéines dans leur état natif afin de fournir des indications sur leur rôle dans des systèmes biologiques.

Développement et caractérisation de techniques pour l’amélioration de la sensibilité et de la résolution spatiale des sources MALDI : désolvatation laser et masques

/ Diologent Laurent / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 18-07-2013
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La spectrométrie de masse MALDI est une technique devenue incontournable pour l’analyse des biomolécules et largement employée dans de nombreuses applications. Bien que les performances de cette source soient notoires, celles-ci restent encore limitées en particulier en termes de sensibilité ou encore de résolution spatiale pour des applications telles que l’imagerie MALDI MS. En effet, les rendements de production d’ions sont très faibles en MALDI et chutent encore lorsque la résolution spatiale est augmentée (diminution de l’aire irradiée). Ainsi, les objectifs de ces travaux de thèse ont été de développer et d’étudier deux systèmes permettant d’augmenter la sensibilité. La première partie de ces travaux a donc portée sur la réalisation d’un système permettant la désolvatation des agrégats formés dans le processus MALDI via l’utilisation d’un second faisceau laser interceptant la plume en expansion. Par utilisation d’un laser pulsé émettant à 1064 nm il a été ainsi possible de démontrer une augmentation d’un facteur 2 à 3 de l’intensité des signaux d’analyte. Dans une seconde partie, un système de masques de silicium permettant de réduire les dimensions de la zone irradiée (sans agir sur la focalisation du faisceau laser) a été développé. Les études réalisées pour différentes géométries de ces masques ont permis de démontrer d’une part l’efficacité de ces systèmes pour réduire l’aire de la zone irradiée en coupant le faisceau laser incident tout en maintenant l’intensité des signaux, et d’autre part que certaines géométries particulières permettaient d’obtenir un effet d’augmentation de la sensibilité et de la résolution spectrale.

Implications des proprotéines convertases lors d'infections : de l'activation du pathogène au contrôle de l’immunité

/ Gagnon Hugo / Université Lille1 - Sciences et Technologies, Université de Sherbrooke / 18-12-2012
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Les proprotéines convertases (PC) sont d’importantes enzymes impliquées dans l’activation par clivage de précurseurs protéiques dans la voie de sécrétion cellulaire et qui permettent la régulation de la physiologie animale. Toutefois, les PC ont un rôle particulier lors d’infections, puisqu’elles participent à la fois à l’activation de pathogènes et au contrôle de la réponse immunitaire qu’ils induisent. Cette thèse présente le développement d’un inhibiteur peptidique de PC à des fins thérapeutiques contre les pathogènes et se penche sur le rôle de PC1/3, une PC dite neuroendocrinienne, dans le contrôle de la réponse immunitaire au sein des macrophages. Dans un premier temps, l’inhibiteur de PC a été optimisé par peptidomimétique afin de bloquer l’activation de deux pathogènes activés par les PC, l’un viral et l’autre bactérien. Dans un second temps, l’utilisation de shRNA sur un modèle de macrophages en culture NR8383 et du modèle de souris où PC1/3 est inactivée ont permis de déterminer les conséquences physiologiques et moléculaires de l’inactivation de PC1/3 au sein des macrophages grâce au développement d’une approche par spectrométrie de masse. L’approche par spectrométrie de masse s’est avérée être un catalyseur dans cette recherche et a pu être appliquée à l’étude de tissus de patientes atteintes du cancer de l’ovaire, démontrant ainsi tous les avantages de cet outil. En somme, les résultats de cette thèse montrent la faisabilité d’inhiber les PC pour contrôler les infections et ouvrir de nouvelles perspectives sur le contrôle de l’immunité en établissant les bases moléculaires du rôle de PC1/3 dans le maintien de l’homéostasie immunitaire.

Modalités de recrutement des cellules microgliales dans le système nerveux central lésé chez la sangsue Hirudo medicinalis

/ Bocquet-Garçon Annelise / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 14-12-2012
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Chez la sangsue médicinale, la réparation du système nerveux central (SNC) est conditionnée par le recrutement des cellules microgliales au niveau du site lésé. Deux facteurs chimioattractants, HmIL-16 et HmC1q, homologues à l’IL-16 et au C1q humains, ont été identifiés dans le SNC de la sangsue. Chez l’Homme, l’IL-16 est connue pour exercer une activité chimioattractante sur les cellules CD4+. Or, nos premiers tests in vitro ont montré (i) que la cytokine humaine recrute les cellules microgliales de sangsue et (ii) que HmIL-16 recrute les cellules CD4+ humaines. L’ensemble de ces données suggère la conservation d’une interaction fonctionnelle IL-16/CD4 chez la sangsue. Afin de confirmer cette hypothèse, une stratégie de purification du récepteur de HmIL-16 a été entreprise, suivie d'une caractérisation par spectrométrie de masse. Le C1q humain recrute les cellules immunitaires en se liant à deux récepteurs, le gC1qR et le cC1qR. Chez la sangsue, deux protéines, HmC1qBP et HmcC1qR, homologues aux récepteurs humains, ont été caractérisées dans le SNC. Afin de démontrer l’implication de ces récepteurs dans le recrutement microglial, des expériences d’immunohistochimie et de chimiotactisme ont été réalisées. Enfin, une stratégie de purification par affinité a permis de montrer l'interaction du C1q avec HmC1qBP et HmcC1qR. Le travail de thèse consiste à étudier les interactions moléculaires impliquées dans les processus de recrutement des cellules microgliales, intervenant à la suite d’une lésion du système nerveux de la sangsue. Les données acquises permettent de saisir les premiers mécanismes de la réponse microgliale, essentielle dans la réparation du SNC chez la sangsue.

Histologie moléculaire : développements et applications pour la recherche de biomarqueurs du cancer de l’ovaire

/ Longuespée Rémi / Université Lille1 - Sciences et Technologies, Université de Sherbrooke / 28-09-2012
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Les cancers de l’ovaire épithéliaux (EOC) sont parmi les affections néoplasiques gynécologiques les plus meurtrières dans les sociétés occidentales. Il n’existe actuellement aucune méthode de dépistage efficace de la maladie dans ses phases précoces de développement. Les travaux de ce doctorat furent articulés autour de deux objectifs relatifs à la recherche de biomarqueurs des EOC. Le premier fût le développement des méthodes d’analyses par spectrométrie de masse MALDI pour le criblage global des marqueurs des différents types d’EOC. Une procédure d’extraction des protéines de hautes masses moléculaires sur coupes de tissus à été créée afin de repousser les limites de sensibilité de la méthode. Ensuite, des analyses multivariées ont permis la comparaison des informations spectrales contenues entre des zones histologiques de natures différentes. Tous ces développements ont conduit à la validation au niveau histopathologique d’un biomarqueur de l’immunosuppression associée au cancer de l’ovaire, le fragment C-terminal de PA28 ou Reg-Alpha. Une autre problématique, la détermination de l’origine des EOC, a également pu être étudiée. Le deuxième objectif fût l’exploration de l’implication relative des différents membres des proprotéines convertases dans les EOC, des enzymes clés dans la maturation de nombreux acteurs moléculaires de la progression tumorale. Pour ce faire, des lignées cellulaires SKOV-3, Knock Down des différents membres de ces enzymes ont été créées pour l’étude de la redondance fonctionnelle de celles-ci. Il a alors été possible de déterminer, in cellulo et in vivo que PACE4 est particulièrement influente sur la progression du cancer de l’ovaire séreux.

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