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Methodological development in proteomics and lipidomics applied to the analysis of cultural heritage samples : photochemical synthesis of metallic nanoparticles in flow

/ Mansour Sergui / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 14-12-2018
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La spectrométrie de masse est une méthode analytique puissante qui permet l'analyse de différents types d'échantillons. Ce travail de thèse présente de nouvelles approches en lipidomique et en protéomique appliquées à l'analyse des échantillons de patrimoine culturel par spectrométrie de masse. La première partie de cette thèse propose un développement méthodologique en protéomique pour l'analyse des échantillons archéologiques. Ce travail consiste à optimiser la stratégie "bottom-up" pour l'analyse des traces de protéines piégées dans des céramiques archéologiques conservées dans des contextes très défavorables (exemple: amphore du 1er siècle conservée dans un environnement sous-marin). Au cours de ce travail, nous avons étudié des organismes non séquencés en adaptant une méthodologie de séquençage de novo. Nous avons réussi à démontrer par des preuves analytiques et pour la première fois, la présence de poisson du genre Thunnus au sein d'amphorae Dressel 14. La deuxième partie présente une nouvelle approche pour l'analyse et l’identification de la structure 3D du réseau de polymères réticulés de peintures d’huile de lin. Celle-ci repose sur le développement d'une technique de dépolymérisation douce et de dérivatisation des lipides réticulés afin de les analyser en spectrométrie de masse à haute résolution (FT-ICR MS) dans le but d'accéder au réseau 3D formé par les lipides dans la peinture. Puis, cette méthode a été appliquée à une peinture à l'huile datant du XIXe siècle. Une étude de l'interaction entre les lipides et les pigments a également été effectuée. Enfin, la troisième partie décrit le développement d'une nouvelle méthode de synthèse photochimique en flux des nanoparticules métalliques (argent, or et palladium) ultra-stables dans plusieurs solvants organiques.

La spectrométrie de masse haute résolution : application à la FT-ICR bidimensionnelle et à la protéomique dans les domaines de l’archéologie et la paléontologie

/ Bray Fabrice / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 12-12-2017
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La spectrométrie de masse est une méthode d’analyse qui permet de travailler sur une large gamme d’échantillons. Elle est utilisée dans de nombreux domaines de recherche comme la chimie analytique, la protéomique, la lipidomique et la métabolomique… Dans un premier temps, mon travail s’est focalisé sur le développement d’une méthode indépendante d’analyse de données par spectrométrie de masse à transformée de Fourier bidimensionnelle. Pour augmenter la résolution en première dimension, une analyse FT-ICR 2D avec un échantillonnage non uniforme (NUS) a été développée. L’augmentation de la résolution dans la première dimension a permis l’obtention d’une haute résolution pour les ions précurseurs. La FT-ICR 2D a été utilisée avec succès pour l’analyse de triacylglycérols contenus dans du plasma mais aussi pour l’analyse d’échantillons archéologiques. Dans un second temps, une stratégie protéomique conjointe bottom-up et top-down a été appliquée à l’analyse d’échantillons archéologiques et paléontologiques à partir d’ossements ou de céramiques. Le développement d’une méthodologie bottom-up, a permis à partir d’un ossement d’humérus d’espèce inconnus vieux de 120 000 ans l’identification des protéines et leurs modifications chimiques. Cet ossement a pu être attribué comme appartenant à Homo neanderthalis et les substitutions d’acide aminé avec Homo sapiens cartographiées. Une analyse top-down a été utilisée pour l’analyse d’échantillons archéologiques. Pour la première fois, une protéine (la caséine de lait) a été identifiée dans un échantillon archéologique d’amphore de l’époque de l’empereur Claude (1er siècle de notre ère) grâce la détection de grands fragments de caséine.

Caractérisations structurales multi-échelles d’amidons modifiés

/ Volant Chloé / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 26-10-2017
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A l’interface entre le développement de résines végétales et l’étude des propriétés mécaniques associées, ces travaux se sont focalisés sur la caractérisation structurale d’amidons modifiés chimiquement afin de distinguer des différences structurales induites par les procédés de synthèse. La transposition de méthodes analytiques et de caractérisation structurale ainsi que le développement de méthodes de préparation ont permis de proposer une stratégie de caractérisation multi-échelle pour déterminer les paramètres suivants : composition chimique, degré de substitution, répartition des substituants et organisation des particules. La composition d’amidons modèles a été déterminée par plusieurs techniques, la combinaison des méthodes a mis en évidence une similarité entre les éléments détectés en surface et ceux présents dans la masse. Grâce au développement de méthodes de préparation, la répartition des substituants sur les chaînes et les unités anhydroglucoses a été identifiée et s’est révélée dépendante des procédés de synthèse. Les techniques à l’état liquide ont montré des limitations pour la détermination du degré de substitution des amidons modèles, favorisant une approche par RMN du solide. L’organisation des copolymères a impliqué le développement de méthodes de préparation de fractions ensuite caractérisées par chromatographie ou par couplage flux-force hydrodynamique. L’application de cette stratégie combinant caractérisation moléculaire et macromoléculaire sur des prototypes innovants a permis de mettre en évidence l’influence des procédés de synthèse sur les paramètres ciblés. Des structures particulaires ont été proposées pour chaque type de modification.

Photochemical and photoredox reactions in continuous microreactors : application to cycloaddition, controlled polymerization and radical chemistry

/ El Achi Nassim / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 16-06-2016
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Ce travail consiste à étudier différentes réactions photochimiques en dispositifs microfluidiques en utilisant la lumière UV/visible, par le biais de catalyseurs recyclables métalliques et non-métalliques, pour la synthèse organique aux applications pharmaceutiques et industrielles. En outre, l’utilisation des systèmes microfluidiques dans des chemins optiques miniaturisés de 500 µm résultant en une amélioration d’illumination. Les mesures d’actinométrie chimique confirment que ≈ 98% de la lumière émise atteint le mélange de réaction dans un réacteur fluidique Mikroglas® Dwell Device largement utilisé dans la littérature. Différentes réactions de cycloaddition [2 + 2] utilisées en synthèse totale ont été testées en utilisant un sensibilisateur sous UV. La réaction est quantitative après 2 h contre 47% après 10 h en batch. La polymérisation radicalaire contrôlée (ATRP) a été étudiée en utilisant le catalyseur photorédox éosine Y sous illumination à base de LED vertes. Six heures d'irradiations sont suffisantes pour fournir des polymères mono dispersés aux applications variables (plastiques, latex ...). Ces catalyseurs non-métalliques sont d'une importance capitale car ils sont plus respectueux de l'environnement. Former de nouvelles liaisons C-C et C-O est le cœur de la synthèse organique. L’utilisation de sources LEDs UV et d’un catalyseur photorédox nous a permis de former des produits d'addition (> 99%), à partir d’une part de sels de trifluoroborates et de TEMPO ou d’accepteurs de Michaël, d’autre part, après 2,5 min d'irradiation contre 8-24 h en batch. Ce travail montre clairement l’apport des systèmes microfluidiques pour l’accélération de réactions photochimiques.

Methodological developments based on mass spectrometry for the analysis of glycoproteins and polysaccharides of plant gums : an application to cultural heritage samples

/ Granzotto Clara / Université Lille1 - Sciences et Technologies, Università Ca'Foscari (Venise, Italie) / 18-12-2014
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L’analyse d’échantillons du Patrimoine Culturel est primordiale pour la compréhension des techniques, la conservation des œuvres et leur restauration. Ces échantillons sont rares et précieux et l’analyse doit être effectuée sur une faible quantité de matière, ce qui nécessite le développement et l’optimisation de méthodes analytiques appropriées. L’objectif de ce travail de thèse a donc été de développer de nouvelles méthodes analytiques dans le but d’étudier les glycoprotéines et les polysaccharides de gommes végétales des échantillons du Patrimoine Culturel. Les macromolécules ont été séparées par chromatographie d'exclusion stérique et électrophorèse sur gel de polyacrylamide modifié, révélant la présence de poids moléculaires très élevés pouvant atteindre jusqu’à 1 à 2 millions de Dalton. Une stratégie analytique innovante basée sur la spectrométrie de masse a permis d’obtenir des empreintes caractéristiques de chaques gommes. La stratégie analytique développée a été appliquée avec succès sur un échantillon d'aquarelle daté de 1870 du Metropolitan Museum of Art (New York, USA).

Nouvelle génération de colonnes capillaires ouvertes de dimension micronique pour l’analyse protéomique basées sur la fonctionnalisation de surface

/ Zemmour Samira / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 04-04-2013
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La miniaturisation des systèmes séparatifs est en plein développement aujourd’hui. Cette évolution se justifie par le très faible volume de l’échantillon et la nécessité croissante de gagner du temps d’analyse. Cette thèse comporte deux parties. La première partie consiste à développer une nouvelle génération de colonnes capillaires ouvertes (« open tubular ») de dimension micronique basées sur la fonctionnalisation de surface et de caractériser leurs propriétés en analyse protéomique pour la séparation de digests peptidiques par chromatographie liquide en phase inverse. La fonctionnalisation de surface a été réalisée après activation de la paroi de silice du capillaire par greffage de dérivés silylés comprenant le motif méthacrylate de glycidyle. La fonction époxyde a ensuite été ouverte par des amines primaires aliphatiques afin d’augmenter l’hydrophobicité de la phase stationnaire. Cette stratégie en deux étapes a l’avantage de permettre de dissocier le greffage de l’introduction du motif fonctionnel et de permettre une plus grande variété de fonctionnalisation. Ces colonnes ont été testées sur des peptides standards ou sur des digests peptidiques avec une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF hors-ligne et en ligne en couplage nanoLC nanoESI-trappe ionique. Les effets des différents paramètres sur la rétention des peptides ont été étudiés en particulier la longueur de la chaîne alkyle. Les tests montrent que chaque fois que l’on diminue la longueur de la chaîne carbonée de l’amine, les peptides sont élués à un plus faible pourcentage d’acétonitrile. En effet le raccourcissement de la chaîne carbonée conduit à la décroissance des interactions hydrophobes, ce qui conduit les peptides à être élués plus rapidement. La deuxième partie de la thèse présente les premiers développements de greffage de polymère à empreinte moléculaire (acronyme anglais MIP pour Molecular Imprinted Polymer) pour la séparation de peptides et de protéines. La synthèse d’une phase à empreinte moléculaire est réalisée à partir d’un mélange de monomères portant des fonctions acides ou basiques et d’une molécule empreinte qui interagit au cours de la polymérisation par des liaisons non covalentes. Une fois la polymérisation achevée, la molécule empreinte est éliminée de la matrice polymérique, ce qui conduit à la formation d’un polymère rigide renfermant des sites de reconnaissance spécifiques de la molécule modèle. Les colonnes à empreinte moléculaire visent à retenir sélectivement la molécule ciblée ou des molécules proches en taille et en structure, au sein d’un mélange complexe par des interactions spécifiques. Une affinité entre deux peptides différents a été obtenue avec une bonne sélectivité. La préparation des colonnes MIP et NIP (polymère non imprimé) a été effectuée afin de comparer le pouvoir de rétention des deux matériaux et de vérifier la sélectivité de recapture du MIP par rapport au NIP vis-à-vis de la molécule cible. Ces colonnes ont également été testées par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF.

Les résidus cystéines en positions 2 et 12 de RGS4 influencent son trafic intracellulaire et ses fonctions

/ Bastin Guillaume / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 29-01-2013
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Les protéines RGS (Regulator of G-protein Signaling) sont des inhibiteurs des voies de signalisation des protéines G. RGS4 atténue l’activité de protéines G dans plusieurs tissus tel que la diminution de son activité peut accroître la sévérité de la bradycardie, cardiomyopathies liées au diabète, l’invasion de cellule cancéreuse du sein, résistance à l’insuline et intolérance au glucose. RGS4 a été localisé à la membrane plasmique ainsi que dans des compartiments intracellulaires, cependant, son mode de trafique intracellulaire reste méconnu. En utilisant des outils de microscopie confocale sur cellules vivantes et méthode de détection d’activité des voies de signalisation conditionnée par les protéines G, nous avons caractérisé l’importance de deux sites de palmitoylation, ces deux sites : Cys2 et Cys12 montrent des intérêts complémentaires dans le trafic de RGS4 vers la membrane cellulaire. Dans un axe linéaire, nous avons identifié DHHC3 et 7, deux enzymes de palmitoylation participant au trafique intracellulaire de RGS4 et donc à la maximalisation de son activité inhibitrice des voies de signalisation contrôlées par Galphaq. Enfin des marqueurs de membranes endosomales, les protéines rab ont permis de caractériser les voies de trafic intracellulaire empruntée par RGS4, par exemple RGS4 est internalisé de la membrane plasmique par Rab5 et recyclé à la membrane cellulaire par Rab11. L’activation ou inhibition de Rab5 et 11 ont permis d’observer des changements d’activité de RGS4. Ces travaux confèrent une base de données pour des études ultérieures visant à développer des stratégies thérapeutiques à accroître les fonctionnalités de RGS4.

Etude de l’activité catalytique de nanoparticules métalliques supportées en réacteur microfluidique de taille caractéristique micronique : application en oxydation sélective

/ Ftouni Jamal / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 05-11-2012
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Dans ce manuscrit sont exposées les possibilités qu’offre la microfluidique, science des fluides à travers des canaux micrométriques, dans le domaine de la Catalyse aussi bien pour la synthèse de matériaux catalytiques que pour l’élaboration des microréacteurs. La première partie de ce travail a consisté en la transposition à l’échelle microfluidique de la synthèse de particules d’or suivant le protocole Turkevich réalisé classiquement en verrerie de laboratoire. Grâce aux propriétés fines de contrôle possibles à l’échelle micrométrique (température, débits et concentration des réactifs), il a été possible, par la mise en place d’un système microfluidique simple, d’obtenir des particules d’un diamètre bien inférieure (1.8 nm) avec une faible distribution de taille par rapport à celles obtenues en verrerie classique (15 nm). Afin de caractériser la formation de nouveau type de nanoparticules au sein du système microfluidique, différentes techniques ont été employées, des plus communes (spectro. UV-Visible, MET), au plus modernes comme la diffusion dynamique de la lumière (DLS) ou la spectroscopie d’absorption des rayons X (XANES) au synchrotron SOLEIL. En deuxième partie est exposé le développement d’un microréacteur catalytique fonctionnalisé par les particules d’or à partir de capillaires micrométriques. Après caractérisation de la nature et quantification de la phase active sur la surface interne du capillaire, le microréacteur est testé sur une réaction modèle d’oxydation de l’alcool benzylique en phase liquide. Sa réactivité, comparée à un réacteur classique, a permis de mettre en évidence l’apport de cette technologie microfluidique par rapport aux technologies existantes.

Organic reactivity : kinetics studies and synthesis optimization, using microfluidic devices

/ Gholamipour-Shirazi Azarmidokht / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 12-12-2011
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Les microsystèmes sont des réacteurs extraordinaires pour mettre en œuvre des réactions chimiques car ils apportent un rapport de contact entre phases très supérieur à celui en ballon, la possibilité d’hypertrempe thermique tant au chauffage qu’au refroidissement et enfin l’absence d’interaction des réactifs avec les produits. Les dimensions micro-ou nanométriques de ces réacteurs sont très largement compensées par la possibilité de parallélisation à grande échelle de ces réacteurs qui permet une montée en échelle de la production sans nouveau développement. Nous avons choisi comme réaction test l’alkylation des acides benzoïques substitués par l’iodure de méthyle en présence d’une éponge à proton (TMGN). Cette réaction a été choisie car elle suit une cinétique parfaitement du second ordre. Nous avons ainsi pu montrer que cette réaction suit la relation de Hammett, déterminer le paramètres de réactivité  pour cette réaction et en opérant à température variable mesurer l’énergie et l’entropie d’activation. Nous avons également réalisé des expériences préparatives sur des substrats bifonctionnels simples et mis en évidence la sélectivité en système microfluidique. Une étude comparative de la basicité des superbases organiques comparée à la vitesse d’alkylation par l’iodure de méthyle a effectué pour mieux cerner le rapport basicité, nucléophilie de ces bases qui est peu étudié. Parallèlement l’alkylation d’un polyphénol complexe la quercétine et de substrats à haute valeur ajoutée tels que le Trolox, l’acide clofibrique et l’acide podocarpique à l’aide de systémes microfluidiques ont été étudié à l’échelle de la millimole.

Etude des protéines dans les échantillons du patrimoine culturel par spectrométrie Raman et analyse protéomique

/ Dallongeville Sophie / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 21-11-2011
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L’analyse d’échantillons du Patrimoine Culturel est primordiale pour des questions de compréhension de technique, conservation et restauration. Cependant, ces échantillons sont rares et précieux et l’analyse doit être effectuée sur une faible quantité de matière, ce qui nécessite le développement et l’optimisation de méthodologies analytiques appropriées. L’objectif de ce travail de thèse a été de développer des méthodes analytiques dans le but d’étudier les protéines dans des échantillons du Patrimoine Culturel. Les changements structuraux et les modifications chimiques des protéines des liants de peinture, provoqués par interaction avec les autres composés ou par le vieillissement ont été mis en évidence grâce à l’utilisation de la micro-spectrométrie Raman et de l’analyse protéomique. Les travaux ont ensuite ciblés un type de substance protéique abondamment utilisé en tant qu’adhésif et liant de peinture : la colle animale. Une méthodologie, basée sur l’analyse par spectrométrie de masse à haute résolution et permettant l’identification de l’espèce d’origine des colles animales est présentée. Elle a été appliquée avec succès sur un échantillon de dorure du 18ème siècle révélant ainsi la nature de la colle animale utilisée pour la préparation de la couche d’apprêt et pour la fixation des feuilles d’or. Enfin, une problématique liée à l’identification du contenu des amphores, qui est à l’heure actuelle un véritable challenge à cause des conditions de conservation des objets archéologiques a été abordée. Le développement d’une méthode d’analyse protéomique permettant d’identifier les résidus de protéines, piégés dans les tessons d’amphores archéologiques est exposée.

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