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Relations, interactions et fonctions des protéines alternatives

/ Cardon Tristan / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 10-10-2019
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Si en transcriptomique le dogme accepté par la communauté veut qu’un ARNm code pour une protéine unique, la protéomique vient de montrer l’inverse. Force de constater que les ARNm peuvent traduire plusieurs protéines. Celles ne suivant pas le cadre de référence sont appelées protéines alternatives (AltProts) et forme le protéome caché ou fantôme. Ces AltProts nécessitent la mise en place de stratégies adaptées pour leur mise en évidence. Leurs caractéristiques physicochimiques spécifiques, telles que leur petite taille permet d’adapter les méthodes classiques de protéomique à leur étude. Dans cet objectif la mise en évidence des AltProts par différentes méthodes d’extraction, notamment adaptées des méthodes de peptidomique, a permis de mettre en évidence les conditions d’enrichissement avant une analyse bottom-up. Ces AltProts sont une nouvelle classe de protéines pour laquelle très peu d’informations fonctionnelle sont connues. Les prédictions de fonction avancées lors des premières constructions de base de données, annonçaient des fonctions dans la régulation des ARN, de la synthèse de protéines et de la régulation d’expression des gènes par association avec des facteurs de transcriptions. Ces prédictions étaient basées sur les homologies de séquences entre les AltProts et les protéines de références (RefProts). Cependant très peu d’études montrent le rôle de ces protéines de manière expérimentale. Afin de mettre en évidence les fonctions de ces AltProts, nous avons choisi de retrouver leurs partenaires d’interaction. À l’heure actuelle, plusieurs méthodes existent permettant d’étudier l’interactome des protéines, toutefois la majorité est dirigée vers une cible, nécessitant parfois des constructions biochimiques ou l’utilisation d’anticorps dirigés, rendant ces méthodes difficiles à mettre en place pour les AltProts. Seule la méthode de Crosslink couplée à la spectrométrie de masse (XL-MS) permet d’observer des interactions cellulaires de manière non ciblée. Cette méthode de pontage chimique, bien que connaissant ses propres limitations, est applicable à la recherche des partenaires d’interaction des AltProts. Cet outil, associé aux logiciels de traitement des réseaux d’interaction, enrichi par les interactions connues entre RefProts dans la littérature, permet de replacer les AltProts dans ces réseaux. Ces réseaux, peuvent ensuite être traités afin de mettre en évidence les voies de signalisation impliquant les RefProts et ainsi déduire les différentes voies de signalisation associées aux AltProts observées crosslinkées aux RefProts.

Étude des microARNs dans les vésicules extracellulaires microgliales : signatures et neuroprotection

/ Lemaire Quentin / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 30-09-2019
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Dans le Système Nerveux Central (SNC), les cellules gliales influencent les activités neuronales. Les cellules microgliales, cellules immunitaires résidentes du SNC, contrôlent grandement l’état neuroinflammatoire. Ce contrôle est particulièrement important dans les fonctions physiologiques et s’avère souvent défectueux dans les neuropathologies. Les cellules microgliales sont en relation avec le microenvironnement cérébral et communiquent avec les autres types cellulaires (astrocytes, oligodendrocytes et neurones) afin de contrôler l’état neuroinflammatoire. Parmi les différents modes de communication intercellulaire au sein du SNC, les vésicules extracellulaires (VEs) interviennent largement dans les processus physiologiques (développement, homéostasie…) et pathologiques (maladies neurodégénératives…). C’est pourquoi, ce mode de communication a été étudié dans le dialogue entre la microglie et les neurones chez la sangsue Hirudo medicinalis. Cet annélide est un modèle intéressant de neurobiologie grâce à la structure linéaire de son système nerveux et à l’organisation de ses types cellulaires. Il permet l’étude du dialogue entre les cellules microgliales et les neurones au niveau d’une lésion expérimentale. Dans un premier temps, les résultats ont montré que les cellules microgliales interagissent avec les neurones lors d’une lésion du SNC et que des VEs sont libérées au niveau de cette lésion. De plus, les cellules microgliales produisent des VEs qui interagissent avec les neurones et délivrent un effet neurotrophique in vitro sur des neurones de sangsue et de rat. Dans un deuxième temps, la complexité des composés vésiculaires ainsi que des impératifs d’efficacité liés aux méthodes d’isolement nous ont conduits à développer l’analyse protéomique non ciblée et à grande échelle afin de valider les fractions positives en VEs mais aussi identifier leurs signatures protéiques biologiquement actives. Dans une dernière partie, nous nous sommes intéressés aux microARNs (miARNs) contenus dans les VEs microgliales. Les résultats ont permis l’identification de 6 miARNs dans les VEs microgliales, dont un seul, miR-146a, est décrit à ce jour dans le SNC chez les mammifères. Dans un contexte de dialogue neuroprotecteur entre VEs microgliales et neurones, les analyses neuronales ont prédit des ARNm potentiellement régulés par les miARNs contenus dans les VEs. Ces 6 miARNs ont également été identifiés dans les VEs issues de microglie de souris, de rat et humaine. Dans leur ensemble, les résultats montrent que les cellules microgliales chez la sangsue produisent des VEs, ayant un effet neurotrophique sur les neurones, y compris des neurones de rat. L’identification des molécules présentes dans ces VEs (protéines et miARNs) a permis de soulever des perspectives sur les mécanismes neuroprotecteurs supportant ce dialogue microglie-neurone qu’il sera intéressant d’examiner chez les mammifères dans un contexte de lésion nerveuse.

Caractérisation des vésicules extracellulaires (VEs) d’origine microgliale et mise en évidence de leur effet neurotrophique

/ Arab Tanina / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 18-01-2019
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Les cellules microgliales sont considérées comme les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC). De nombreuses études ont démontré que ces cellules sont activées et recrutées sur le site de lésion. Les cellules microgliales de sangsue présentent un mode d’activation et de migration similaires post lésion expérimentale du SNC. Cette activation est accompagnée d'une libération massive de vésicules extracellulaires (VEs). Les VEs sont de petites particules produites par la plupart des types cellulaires et sont présentes dans plusieurs liquides biologiques, notamment la salive, l'urine, le lait maternel, le plasma et le liquide céphalo-rachidien ... Leur taille varie entre 30 nm et 1 µm de diamètre. Selon leur origine cellulaire, deux populations principales ont été décrites. Les exosomes qui sont connus comme des vésicules d'origine endosomales et les microvésicules qui sont générées suite au bourgeonnement de la membrane plasmique. Les travaux portent sur l'isolation de VEs libérées par des cellules microgliales en culture primaire. Chez la sangsue, ces dernières sont séparées des populations de neurones suite à la dissociation du SNC. Après quatre jours de culture, les VEs des cellules microgliales ont été isolées du milieu et leur contenu protéique a été analysé par spectrométrie de masse. D'autre part, les VEs isolées ont été également testées in vitro pour leur potentiel à induire une croissance neuritique à la fois sur les neurones de sangsue et des lignées cellulaires de neuroblastome de mammifères.

Implication de la signalisation ALK4/5 dans le dialogue entre les neurones et les cellules microgliales chez la sangsue Hirudo medicinalis

/ Raffo Romero Antonella / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 15-01-2019
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Dans le système nerveux central (SNC), toutes les activités neuronales sont sous l’influence des cellules gliales environnantes, incluant notamment les cellules microgliales. Ces cellules immunitaires résidentes du SNC régulent l’état neuroinflammatoire, si important dans les maladies neurodégénératives. Dans la microglie, les récepteurs du TGF-β de type I (ALK5) et de type II ont récemment été décrits comme une signature spécifique par rapport aux macrophages méningés ou infiltrants depuis le sang, permettant la maintenance/maturation de la microglie. Ces récepteurs sont également utilisés par les neurones en développement sous l'influence de membres de la famille TGF-β, incluant plusieurs GDFs (facteurs de croissance et de différenciation). C’est pourquoi, cette signalisation ALK4/5 a été étudiée dans le dialogue entre cellules microgliales et neurones chez la sangsue H. medicinalis. La sangsue médicinale est un modèle de neurobiologie qui, par sa structure nerveuse intéressante, offre la possibilité d’étudier les interactions entre sous-populations microgliales et neurones. Les résultats ont montré que les neurones et la microglie utilisent tous les deux la signalisation ALK4/5 dépendamment d’un membre de la famille TGF-β, appelé nGDF, pour maintenir des échanges mutuels après une lésion axonale. En effet, une libération neuronale immédiate de nGDF après une blessure axonale permet le recrutement précoce de microglie ALK4/5+ au point de la lésion tandis que, plus tardivement, la production de nGDF dans des cellules microgliales active de façon paracrine les neurones ALK4/5+. Ce second temps de dialogue permet aux neurones d’induire la production d'autres signaux chimiotactiques et ainsi maintenir l’accumulation de la microglie. Dans leur ensemble, les résultats permettent un nouvel aperçu de la compréhension de la voie ALK4/5 en tant que signal régulateur guidant une mobilisation chronologique correcte du recrutement de la microglie dans un cerveau adulte capable de régénération axonale. Les résultats ouvrent la perspective d’une telle étude chez les mammifères adultes afin de préciser la pertinence de ce dialogue dans le cerveau soumis à des lésions accidentelles ou pathologiques.

In depth systemic biology analysis of central nervous system injuries

/ Mallah Khalil / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 13-12-2018
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Dans un contexte d’étude des altérations biologiques survenant après un impact sur le système nerveux central (SNC), ma thèse porte sur l’étude des modifications protéomiques et lipidiques survenant après une lésion du SNC. Une étude spatio-temporelle a été menée sur un modèle TBI de rat afin d'identifier des marqueurs spécifiques de la lésion. En utilisant le MALDI-MSI, nous avons effectués une reconstruction 3D du cerveau lésé 3 jours post-lésion et nous avons représentés les molécules lipidiques spécifiques à la lésion. Après, cette analyse est réalisé avec d’autres délais après l’impact: 1, 3, 7 et 10 jours. En parallèle, une analyse microprotéomique est réalisée sur des coupes de tissus dans une approche visant à corréler les modifications lipidiques et protéiques. Nos résultats ont permis d'identifier une famille de lipides, les acylcarnitines, exprimés dans le cortex lésé avec une intensité maximale à 3 jours post-impact. Les données de protéomiques ont montrés une régulation positive de l’expression de protéines liées à la maladie de Parkinson. Dans l’ensemble, nos résultats décrivent un lien entre le TBI léger et la maladie de Parkinson dès 3 jours après l’impact, avec un rôle possible de l’acylcarnitine. Cette même famille de molécules est aussi présente dans les lésions médullaires. Dans une approche thérapeutique, les résultats précédents ont montrés que la protéine RhoA est un candidat majeur dans SCI. Après avoir utilisé un inhibiteur de RhoA, une étude protéomique a été réalisée pour évaluer l’impact sur ces lésions. Les résultats montrent que les traitements in-vivo et in-vitro avec l’inhibiteur stimule la croissance neuritique et la régénération axonale.

The role of microglia derived extracellular vesicles in inflammatory and tumorous processes of the CNS : in vitro study

/ Murgoci Adriana-Natalia / Université Lille1 - Sciences et Technologies, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach / 26-09-2018
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Dans cette étude on décrit une méthode reproductible et efficace pour isoler des cellules microgliales et leurs exosomes. Les résultats montrent qu'il n'y a pas de différences morphologiques entre les cellules microgliales issues d'origines tissulaires différentes e.g. cortex et moelle épinière. D'autre part, en utilisant une plateforme de protéomique à grande échelle, nous démontrons que les microglies dérivées du cortex et de la moelle épinière des rats expriment des phénotypes différents tant dans les conditions physiologiques normales ou inflammatoires. Cette différence a été confirmée également au niveau des exosomes qu’elles sécrètent. Des essais biologiques in vitro démontrent que les exosomes dérivées de microglies testées sur des sphéroïdes 3D de gliomes de rat étaient capables d'inhiber l'invasion tumorale. Ces résultats ont permis de mettre en évidence que des exosomes dérivées de la microglie pouvaient être utilisés comme agents nano thérapeutiques vis-à-vis des gliomes. Sur la base des études précédentes conduites au laboratoire, nous avons montré que les EVs isolées à partir de macrophage KD PC1/3 traitées avec Paclitaxel inhibaient la croissance de la lignée C6 de gliome de rat. Nous avons isolé les exosomes et nos résultats mettent en valeur le potentiel d'une stratégie thérapeutique combinant Paclitaxel et inhibition de PC1/3 et utilisation des exosomes produits par ces cellules comme agents thérapeutiques.

Développement de stratégies protéomiques pour la découverte de nouvelles protéines codées dans des séquences codantes non canoniques chez les eucaryotes

/ Delcourt Vivian / Université Lille1 - Sciences et Technologies, Université de Sherbrooke (Québec, Canada) / 14-12-2017
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La vision traditionnelle de la synthèse protéique chez les eucaryotes comprend un ARN messager (ARNm) qui porte un seul cadre de lecture ouvert (ORF). Chaque gène codant eucaryote produit généralement une protéine canonique et éventuellement une ou plusieurs isoformes. Cependant, de nombreuses évidences expérimentales récentes démontrent que le protéome des eucaryotes a été sous-estimé, et que les cellules sont capables de synthétiser des protéines qui n’étaient jusqu’alors pas prédites. Ces nouvelles protéines « alternatives » (altProts) peuvent être issues de la traduction d’ORFs non annotés contenus sur des ARNms, ou des ARNs non codants. Ces découvertes ont été possibles grâce aux progrès techniques réalisés en biochimie analytique en protéomique par spectrométrie de masse. Dans le cadre de ces analyses, deux approches sont privilégiées. La première, ou bottom-up se base sur les produits peptidiques issus d’une digestion enzymatique des protéines quand la seconde ou top-down est basée sur la mesure des protéines entières. Les travaux réalisés dans cette thèse s’articulent autour du développement de stratégies pour la découverte et la caractérisation des altProts par approches protéomiques bottom-up et top-down. Ces aspects sont décrits dans plusieurs publications scientifiques qui seront présentées dans ce manuscrit. Elles comprennent une revue de bibliographie, deux publications relatives à l’application de l’approche top-down par micro-extractions de tissus de cerveau de rat et de biopsie tumorale ovarienne et une publication relative à la détermination de la stœchiométrie de deux protéines, l’une alternative et l’autre canonique toutes deux issues du même gène.

Spatio-temporal studies of the spinal cord injury through OMICs and physiological approaches

/ Devaux Stéphanie / Université Lille1 - Sciences et Technologies, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach / 07-10-2016
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Les lésions de la moelle épinière (LME) appartiennent aux troubles incurables du système nerveux central. Les symptômes cliniques sont la conséquence des modifications dégénératives liées principalement à une inflammation aiguë, à la démyélinisation des axones et la formation d’une cavité qui perturbe les voies axonales. Nous mimons la LME grâce à la technique de ballon compression au niveau thoracique Th8-9 chez le rat. Une première étude a montré une régionalisation des protéines sécrétées 3 jours après lésion avec au niveau rostral un profil neuroprotecteur et au niveau caudal un profil neuroinflammatoire et apoptotique. Une étude spatio-temporelle a ensuite été mené pour compléter ces premiers résultats. Nous avons mis en évidence une symétrie entre les segments rostral et caudal avec la présence de facteurs neurotrophiques mais également d’inhibiteur de croissance neuritique au niveau caudal (lectines et RhoA). Des immunoglobulines ont été identifiés et semblent être colocalisées avec certains neurones. L’utilisation de biomatériaux injectés au niveau de la lésion permet de combler la cavité mais aussi de servir de réseau pour une future croissance axonale. Les alginates ont la capacité de libérer des facteurs qui permettront de moduler l’inflammation et de promouvoir la repousse neuritique. Les premiers résultats concernant l’injection de l’inhibiteur de RhoA tendent à montrer une augmentation de la repousse neuritique et des vésicules synaptiques au sein de la lésion. L’ensemble de ces résultats ont clairement démontré une évolution spatio-temporelle du profil moléculaire et ont défini le segment caudal comme étant une potentielle cible de traitement.

De la classification moléculaire des gliomes à une nouvelle stratégie thérapeutique de réactivation des macrophages au sein de la tumeur

/ Duhamel Marie / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 23-09-2016
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Les tumeurs sont très hétérogènes à la fois au niveau moléculaire et au niveau de la diversité cellulaire composant leur microenvironnement. La classification des gliomes repose actuellement sur des critères histologiques qui sont enclins à de fortes subjectivités inter- et intra-observateurs. Le but de ce projet est de réaliser une classification moléculaire des gliomes de haut grade en se basant sur des données protéiques permettant de localiser des biomarqueurs potentiels directement sur le tissu. Des sous-régions ayant des profils moléculaires différents ont été mises en évidence et les molécules les composants ont été identifiées. Les résultats démontrent que les annotations histologiques ne concordent pas avec la classification moléculaire. Cette hétérogénéité est également retrouvée dans le microenvironnement des tumeurs où l’on retrouve des cellules immunitaires telles que les macrophages. Les macrophages sont détournés de leur fonction par la tumeur pour lui permettre de se développer. Une stratégie thérapeutique pour contrer sa croissance est de réorienter le phénotype des macrophages vers un phénotype antitumoral. L’inhibition de la proprotéine convertase 1/3 s’est révélée être une stratégie prometteuse pour la réactivation des macrophages via les récepteurs TLR. Les facteurs sécrétés par ces macrophages ont un effet sur la viabilité et l’invasion de différentes cellules cancéreuses en fonction des ligands des récepteurs TLR utilisés. La première partie nous a permis d’identifier des sous-groupes de gliomes qui en fonction de leur profil moléculaire pourront recevoir des traitements personnalisés basés, par exemple, sur l’inhibition de proprotéines convertases.

Développements d’outils de micro-échantillonnage par ablation laser et spectrométrie de masse pour la caractérisation de tissus biologiques

/ Fatou Benoit / Université Lille1 - Sciences et Technologies / 14-12-2015
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L’émergence de nouvelles sources ambiantes d’ionisation rendent possible l’étude par spectrométrie de masse d’échantillons natifs, sans préparation nécessaire. En combinaison avec des méthodes d’échantillonnage, elles permettent l’identification de biomolécules en conservant leur localisation histologique. Dans ce contexte, nous avons développé deux outils de micro-échantillonnage pour la caractérisation de tissus biologiques. Le 1er est basé sur l’ablation laser par une source impulsionnelle à 532 nm suivie de la capture en goutte du matériel ablatée. Nous avons démontré que l'analyse de biomolécules capturées était possible malgré leur faible absorbance à cette longueur d’onde. Ceci est dû à l’existence d’un mécanisme d’ablation induit par le substrat qui se substitue au processus d’ablation directe entre le laser et l’échantillon irradié. Cette stratégie a été appliquée avec succès à l’étude de protéines et de lipides sur tissu. Le 2nd est un nouvel instrument d’analyse de biomolécules en temps réel. Basé sur l’ablation laser à 2,94 µm - en coïncidence avec une bande d’absorption intense de l’eau - et couplé au spectromètre de masse par un tube d’aspiration, il permet la caractérisation de tissus biologiques ex vivo et in vivo. Les profils moléculaires générés correspondent à des métabolites et des lipides. Le caractère faiblement invasif et indolore de l’irradiation laser a été démontré lors d’études in vivo sur des phalanges d’individus volontaires. Le potentiel de ce dispositif est finalement démontré par une application clinique, le cancer de l’ovaire et le développement de banques de données de profils moléculaires correspondant aux différents grades de la pathologie.

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